质粒改造修改实用教案

1、会计学1质粒改造质粒改造(gizo)修改修改第一页，共30页。载体载体外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿主细胞引入宿主细胞abbA重重组组Ab抗性筛选抗性筛选重组筛选重组筛选DNADNA重组重组(zhn z)(zhn z)技术技术第1页/共30页第二页，共30页。质粒改造质粒改造(gizo)历程历程阅读阅读(yud)质粒图谱质粒图谱实验实验(shyn)常见问题及注意事项常见问题及注意事项 领域最新进展或现实意义领域最新进展或现实意义第2页/共30页第三页，共30页。 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克

2、隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工(rngng)构建。 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1,pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 发展发展(fzhn)概概况况质粒改造质粒改造(gizo)历程历程第3页/共30页第四页，共30页。 1）pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。最早

3、应用于基因工程的载体之一。 2）由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 3）把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用(shyng)的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。pBR322pBR322重要(zhngyo)的大肠杆菌质粒载体第4页/共30页第五页，共30页。4）过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的(md)基因的优越条件。 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电

4、泳的分子质量标准。第5页/共30页第六页，共30页。pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr松弛松弛(sn ch)(sn ch)型复制型复制 pBR322pBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于基因用于基因(jyn)(jyn)克克隆隆 第6页/共30页第七页，共30页。pUCpUC质粒系列质粒系列(xli)(xli) pUC质粒系列(xli)也是在pBR

5、322基础上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker. 第7页/共30页第八页，共30页。三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。 其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上

6、克隆的目的基因直接(zhji)转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。第8页/共30页第九页，共30页。NoImage476bp476bp片段含有片段含有E.coliE.coli的的lacZlacZ基基因的因的 5- 5-序列序列(xli)(xli)，表达，表达半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的片段。片段。LacZLacZ的上游包括乳糖操纵子上的上游包括乳糖操纵子上的启动子的启动子PlacPlac和操纵基因和操纵基因O O。lacZlacZ之内是之内是M13M13的多功能连接器的多功能连接器。第9页/共30页第十页，共30页。阅读阅读(yud)质粒图谱质粒图谱第10页/共30页第十一页，共

7、30页。第11页/共30页第十二页，共30页。第12页/共30页第十三页，共30页。第13页/共30页第十四页，共30页。第14页/共30页第十五页，共30页。第15页/共30页第十六页，共30页。第16页/共30页第十七页，共30页。实验实验(shyn)常见问题及注意事项常见问题及注意事项酶切问题酶切问题(wnt)(wnt)分分析析 连接注意事项连接注意事项 结果鉴定结果鉴定第17页/共30页第十八页，共30页。 非特异性扩增非特异性扩增 拖尾拖尾 假阳性假阳性(yngxng)(yngxng) PCR PCR常见问题分析常见问题分析(fnx)(fnx)第18页/共30页第十九页，共30页。1

8、.1.模板模板: :含有含有(hn yu)(hn yu)抑制物，抑制物，含量低含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解4.4.反应条件：退火温度太高，延反应条件：退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原因原因(yunyn)对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提纯化模板或者使用试剂盒提取模板取模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚体重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新和链内二级结构）或者换一管新

9、引物引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；第19页/共30页第二十页，共30页。 非特异性扩增非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大扩增后出现的条带与预计的大小小(dxio)(dxio)不一致，或大或小，或者同时不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第20页/共30页第二十一页，共30页。1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.Mg2+Mg2+浓度偏高浓度偏高5.5

10、.退火退火(tu hu)(tu hu)温度偏低温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原因原因(yunyn)对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢式重新设计引物或者使用巢式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用二阶段适当提高退火温度或使用二阶段温度法温度法6.6.减少循环减少循环(xnhun)(xnhun)次数次数 第21页/共30页第二十二页，共30页。 拖尾拖尾 现象现象(xinxing)(xinxing)：产物在凝胶上呈：产物在凝胶上呈SmearSmear（弥散）

11、状态。（弥散）状态。 M 1 2第22页/共30页第二十三页，共30页。1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、Mg2+Mg2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数循环次数(csh)(csh)过多过多 原因原因(yunyn)对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子和镁离子(lz)(lz)的浓度的浓度6.6.减少循环次数减少循环次数第23页/共30页

12、第二十四页，共30页。 假阳性（筛选转基因、检测(jin c)基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物(chnw)的交叉污染 现象：空白对照出现目的(md)扩增产物对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 第24页/共30页第二十五页，共30页。第25页/共30页第二十六页，