育种学尹继乾

1、 体细胞杂交（原生质体融合）体细胞杂交（原生质体融合）体体细细胞胞杂杂交交研研究究历历程程及及一一般般概概念念体体细细胞胞杂杂交交的的一一般般流流程程细细胞胞融融合合的的类类型型 123杂杂种种细细胞胞的的选选择择41.体细胞杂交的含义及研究历程体细胞杂交的含义及研究历程 2.植物细胞融合的程序植物细胞融合的程序3. .细胞融合的类型细胞融合的类型4. .杂种细胞的选择杂种细胞的选择5.原生质体融合的应用原生质体融合的应用1.体细胞杂交的含义及研究历程体细胞杂交的含义及研究历程概念：概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从而发

2、生膜融合、胞质融合、工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。使植物无性杂交成为可能使植物无性杂交成为可能使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实缘杂种成为现实打破了物种间的界限打破了物种间的界限原生质体融合的意义原生质体融合的意义 2.2.植物细胞融合的程序植物细胞融合的程序： 原生质体分离的分离、纯化原生质体分离的分离、纯化 融合方法选择融合方法选择 杂种

3、细胞的筛选杂种细胞的筛选 愈伤组织形成愈伤组织形成、分化植株再生分化植株再生 杂种植物的鉴定杂种植物的鉴定原生质体融合的方法原生质体融合的方法聚乙二醇聚乙二醇 PEG）化学方法化学方法电脉冲电脉冲物理方法物理方法生物方法生物方法仙台病毒仙台病毒(Sendai virus)NaNO3处理处理高高pH-高浓度高浓度Ga2+飞秒激光诱导融合飞秒激光诱导融合电融合电融合空间细胞融合空间细胞融合（1）电融合法：电融合法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。

4、性电击穿，达到原生质体融合的方法。电融合特点：电融合特点： 效率高效率高 对原生质体伤害性小对原生质体伤害性小 对融合细胞数易于控制对融合细胞数易于控制方法：方法：微电极法和双向电泳法微电极法和双向电泳法双向电泳法：双向电泳法：电融合仪电融合仪微电极法：微电极法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。电击穿，达到原生质体融合的方法。1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近；此靠近；2、两个相邻原

5、生质体之间的质膜相互融合，随后、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布；脂等成分也在融合后的质膜上重新分布；3、细胞质发生融合；、细胞质发生融合；4、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。融合过程：融合过程：（2）聚二乙醇）聚二乙醇 诱导融合法诱导融合法 PEGPEG融合的机理：融合的机理：PEGPEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。蛋白质和碳水化合物等形成氢键。

6、当当PEGPEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类脂膜流动分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类脂膜流动性作用，引发原生质体的粘连。性作用，引发原生质体的粘连。当当PEGPEG分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导致原生质体融合。致原生质体融合。PEGPEG的选用：的选用：一般选择相对分子质量为一般选择相对分子质量为40004000获获60006000PEG PEG 对细胞有毒害作用，用离子对细胞有毒害作用，用离子交换树脂纯化可消除其对细胞的交换树脂纯化可消除其

7、对细胞的毒害作用。毒害作用。优点：优点：成本低、不需要特殊的设成本低、不需要特殊的设备；融合子产生的异核率高；融备；融合子产生的异核率高；融合过程不受物种限制合过程不受物种限制缺点：缺点：融合过程繁琐、融合过程繁琐、PEG可可能对细胞造成毒害能对细胞造成毒害PEG融合所需试剂融合所需试剂 融合液：融合液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇 0.51.0mol 诱导液：诱导液：融合液融合液PEG 2045 稀释液：稀释液： A液（液（g/100ml）pH6.0 B液液 (g/100ml) pH10.5 葡萄糖葡萄糖 7.

8、21 甘氨酸甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169P1P2P1 P2混合静止混合静止1 min.融融 合合融合液融合液加入加入PEG稀稀 释释洗洗 涤涤加入稀释液加入稀释液加入培养基加入培养基培培 养养选选 择择PEG法的流程法的流程P1P2P1 P2融融 合合融合液融合液稀稀 释释洗洗 涤涤培培 养养选选 择择 盐类融合剂种类盐类融合剂种类 硝酸盐类：硝酸盐类：NaNONaNO3 3、KNOKNO3 3、Ca(NOCa(NO3 3) )2 2 氯化物类：氯化物类：NaClNaCl、CaClCaCl2 2 、MgClMgCl2 2 、 BaClBaCl2 2

9、葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合融合（3 3）盐类融合法）盐类融合法（4 4）高）高CaCa2+2+和高和高pHpH值融合值融合 Ca2+浓度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5取分离、纯化好的两种亲本原生质体以取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:11:1的比例混合的比例混合; ;加入加入0.05mol/LCaCl0

10、.05mol/LCaCl2 2.2H.2H2 2O O和和0.4mol/L0.4mol/L甘露醇甘露醇; ;再用甘氨酸钠缓冲调节再用甘氨酸钠缓冲调节pHpH值到值到10.510.5，成为融合液，同时，成为融合液，同时在在3737下保温下保温0.5h;0.5h;用用0.4mol/L0.4mol/L甘露醇洗净高甘露醇洗净高CaClCaCl2 2和高和高pHpH值；值；两种原生质体的融合率达到两种原生质体的融合率达到10%10%。（5 5）生物诱导融合法）生物诱导融合法仙台病毒法仙台病毒法 仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形性颗粒，直径

11、为形性颗粒，直径为5060 nm，由两层磷脂组成的外膜包裹，由两层磷脂组成的外膜包裹着着RNA和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是HANA蛋白质，一种是蛋白质，一种是F蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血凝活性（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量凝活性（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量较小较小）。 诱导细胞融合的机理：诱导细胞融合的机理：病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相接触，表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相

12、接触，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细胞凝集块再通过膜上蛋白质分子的重新排列，使膜中脂类分胞凝集块再通过膜上蛋白质分子的重新排列，使膜中脂类分子重排而打开质膜，最后导致细胞融合。子重排而打开质膜，最后导致细胞融合。 利用仙台病毒诱导细胞融合的步骤：利用仙台病毒诱导细胞融合的步骤：（1）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制

13、成悬浮液、）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制成悬浮液、 混合离心；混合离心；（2）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在4oC低温下摇动低温下摇动20分钟，使细胞形成凝集块；分钟，使细胞形成凝集块；（3）再将温度升至）再将温度升至37oC，间歇摇动，间歇摇动30分钟，使其融分钟，使其融合；合；（4）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培养。养。 由于由于4oC低温利于细胞聚集，在融合时需要提高低温利于细胞聚集，在融合时需要提高温度，否则融合不会发生。温度，否则融合不会发生。3.3.细胞融合的类型细胞融合的

14、类型根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合分为两大根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合分为两大类：对称融合和非对称融合类：对称融合和非对称融合对称融合：对称融合：两个完整的细胞原生质体的融合两个完整的细胞原生质体的融合非对称融合：非对称融合：利用物理或化学的方法使某一亲本的利用物理或化学的方法使某一亲本的核或细胞质失活后再进行融合。融合的结果是获得核或细胞质失活后再进行融合。融合的结果是获得非对称杂种，即两融合亲本对杂种细胞的遗传组成非对称杂种，即两融合亲本对杂种细胞的遗传组成的贡献是不对等的。的贡献是不对等的。4.4.杂种细胞的选择杂种细胞的选择 互补选择：互补选择： 双荧光标记选择法：双荧光标记选择法： 机械选择法：机械选择法：互补选择：互补选择：利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。才能生长的选择方法。互补选择方法：互补选择方法： A、白化互补选择法、白化互补选择法 B、营养缺陷型互补选择、营养缺陷型互补选择 C、抗性互补选择、抗性互补选择 D、代谢互补抑制选择、代谢互补抑制选择 5.原生质体融合的应用原生质体融合的应