基因芯片技术

1、基因芯片技术朱丽雅生物芯片(Biochip)技术 通过加工工艺同时将大量的探针分子固定到固相支持物上后与通过加工工艺同时将大量的探针分子固定到固相支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息并进行高效的解读和分析而获取样品分子的数量和序列信息并进行高效的解读和分析n.基因芯片n.蛋白质芯片n.芯片实验室命名命名：“GeneChip” Affymetrix率先专利注册 Microarray，DNA微阵列通用地位 80年代克隆， 90年代 PCR； 21世纪芯片 Microarra

2、y近10年来生命科学研究领域中的最高效技术之一优点n传统：Northern杂交、RT-PCR和核酶保护性分析等只针对单个基因来分析nMicroarray：高通量模式 研究效率提高成千上万倍 研究层面总体全局的基因之间相互关系 广泛应用基础研究方面如基因表达水平的检测、基因间相互作用模式、基因诊断、测序；产业化方面也有药物筛 选、药物基因组图谱、个性化治疗、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督等许多领域。基本工作流程以Affymetrix GeneChip为例样品制备样品制备标记标记杂交杂交数据获取数据获取和分析和分析样 品制备 n样品 DNA样品样品 RNA样品样品先逆转录成

3、cDNA样品核酸的拷贝数提高达到检测的样品核酸的拷贝数提高达到检测的灵敏度灵敏度样品或后续测试信号适当的样品或后续测试信号适当的放大放大样品样品扩增扩增 同时对样品核酸分子大量的区域进行扩增 e.g. PCR 去除了多余去除了多余 的的RNA （rRNA占约80%）, RNA污染增加非特异性扩增 标记 方法 标记引物 标记三磷酸脱氧核糖核苷酸标记物： 荧光分子直接标记 生物 素间标放大信号荧光标记:单色标记以减 少流程或者芯片制作过程中所造成的控制性差异，确保实验的可靠性和可重复性。双色标记用不同颜色荧光素标记两个引物 杂交反应（关键）n通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减

4、少生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的信号。ndsDNA芯片单链 DNA（ 寡核苷酸）芯片有助于防止双链DNA在杂交时产生干扰，而且芯片上各点寡核苷酸长度相对一致，使得杂交条件较为一致，有助于减少由于双链 DNA长度差别导致杂交条件差异的问题。按载体上所点探针的长度分为：n(1) cDNA 芯片:由Schena 建立,将特定的cDNA 经PCR 扩增后借助机械手直接点到基片上。n(2) 寡核苷酸芯片:由Fodor首先报道,用照相平板印刷术和固相合成技术在基片上生成寡核苷酸, 分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片,与cDNA 芯片制作的一个主要不同点是多一步转录获得cRNA 的过程。

5、n起初,人们认为长寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特异性和灵敏度。但短寡核苷酸芯片同样有效和特异。信号检测 芯片上点的高集成度要求高灵敏度的检测设备。双色标记为例：.芯片 扫描仪采集各反应点的荧光强弱和荧光位置.对每一种染料扫描一定的软件处理并合并得到每个点的重叠图.点数和每点的强度定量确定，确定背景强 度并被减掉.对照点，或是额外加入的序列，或是报道基因，或是每个样本的总的荧光信号强度，来帮助校正两种荧光染料的标记差异和检测效率.两个样本中的每 个基因信号用控制好的强度进行扫描测量.经相关软件分析图像，即可以获得有关生物信息。 芯片的扫描灰度图(对照)（处理）数据分析（复杂）n一位科学院院

6、士说，“以后生物实验室中要有50%-70%的人从事生物信息学工作”呢。而且据统计，国际生物芯片的专利62%都集中在数据分析领 域，可见这一方面确实是芯片研究领域的重点和焦点。n很多芯片产品的供应商都有提供服务项目。n靠自己数据的描述n目的：是通过图形对数据的分布情况进行初步的判断。n散点图是一种常用的方法.n远离对角线的基因为表达差异明显的基因。聚类分析n计算样本（这里指芯片上各个点扫描得到的数据）间的距离，以判断性质是否相近n聚类方法的局限:. 要聚类结果要明确就需分离度很好的数据.由线性相关产生。但生物系统却具有多因素和非线性的特点点, 往往进行简单的分类是无效的。n层次式聚类：计算各数据

7、点间的距离后把相近距离的聚为一组, 再计算各组间的距离使之合并成更大的组, 不断重复这一过程直到最后聚成一组以树状结构重新安排的数据. 其结果直观而且能以树状结构分支的长短来评价基因的相似性.培养的成纤维细胞加入特定刺激物后，用基因芯片的方法研究其表达谱的变化。Time表示十二个时间组（最左边一列未加刺激物），纵向排列的小方格表示基因。绿色表示下调87.5%，红色表示上调8倍。经过聚类分析后，相关的基因被聚集到各自的簇中。A 类基因是与胆固醇合成相关的基因，B 类是细胞周期相关基因，C 类是立即早期反应基因，D 类是与信号传导和血管生成相关的基因，E 类是创伤修复、组织重塑相关基因。软件和网址

8、n树状图：美国斯坦福大学的Cluster软件（下载网址），免费软件。这是Michael B. Eisen 博士写的一个以HierarchicalClustering、PCA、SOMs 和K-means Clustering 为主要功能的免费软件，另外尚有数据过滤功能。在不断升级中。用户界面友好，操作简单易懂，并带有详尽的说明书。其结果可直接被该网站的另一免费软件TreeView 读取，输出标准的树状图。初级用户学习使用也很方便。nhttp:/ nNCBInRPGnSWISSPRO研究方法n .海选：即将样品在基因组芯片上筛选一遍，进行生物信息学分析，这样可以

9、将范围缩小到几个区域n.精细定位和测序：商品化的或者是定制的芯片进一步将范围缩小n.功能飞行：用表达芯片对定位的基因，这一步分析也需要的参与。 NEW500K超大容量SNPs芯片 n基因定位标记：第一代的RFLP（限制性片段长度多态性分析）第二代的STR（短串联重复标记，即微卫星标记新近的SNP（单核苷酸多态性）SNPs 是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换或颠换等变异所引起 的DNA序列多态性。SNP是可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，并且SNP在基因组中广泛存在，因此SNPs是一种非常适合做为基因标记的研究方法。 n利用SNPs进行分析准确性（样品中SNP

10、s比较少）ABI的TaqMan实时荧光PCR全面性（e.g.全基因组的高密遗传分析：特殊性状相关基因定位查找）基因芯片。 n目前已经广泛使用的是Affymetrix的10K，100K 的GeneChip Arrays（其中10K表示10,000个标记）。还推出了500K（25万 SNP密度）n利用 Affymetrix Human Mapping 500K Arrays同时分析了500,000 DNA标记，获得了一张有关记忆研究参予因子的遗传图谱，从中研究人员通过比对记忆力好的和记忆力差的人群，寻找在前者中存在，但在后者中缺失的遗传变 异，最终发现了Kibra基因。Science 20 Oct

11、ober 2006:Vol. 314. no. 5798, pp. 475 - 478DOI: 10.1126/science.1129837Common Kibra Alleles Are Associated with Human Memory Performance megallele探针设计全外显子芯片 n真核生物与原核生物基因调控的重要区别转录后水平的可变剪接 外显子和内含子数目及所在位置如果有不固定的情况，一个基因可以转录成多个不同的成熟mRNA，它的直接后果是一个基因产生多个不同功能的蛋白质。 n各种组织中是否哪个组织会有外显子表 达量特别高的情况？外显子芯片是如何设计探针外显子

12、芯片是如何设计探针 n来自基因组序列n每个Exon当作一个探针选择区（probe selection region, PSR）n每个选择区设计4个以上的探针，n增加一些 预测的外显子序列，Affymetrix的Exon Array就选择了来自GenScan、Ensembl、Vega、Geneid and sgp、microRNA Registry和TwinScan等处的基因序列（并且Affymetrix也把小鼠与大鼠的全长cDNAs包括了进去，以便研究外显子表达进化情 况）。 全外显子芯片得数据分析步骤：n.确定每个外显子在样品中是否有变化。样品本身基因表达就有高 有低可变剪接的存在n.检测整

13、个基因表达本身是否有变化。确定在整个基因中哪儿出现了可变剪接。 Tiling 芯片（嵌合芯片）n适合于全基因组分析的针对所有转录本的DNA微阵列。n全基因组概念上每隔35个bp 设计一段25bp长度的探针。粗略的计算一下，人类基因组共有30亿个bp，就有3千万个探针，正是这么密集的探针数才能保证对整个基因组全转录本的扫描，保证一个也不会少。n发现目前算法和软件无法预测的新的转录本。n转录因子 在基因上不同位置的定位。DNA甲基化、组蛋白乙酰化应用tiling-path芯片对水稻全基因组转录活性进行分析 nNature Genetics 2006 Jan;38(1):124-9 nGenome-

14、wide transcription analyses in rice using tiling microarrays.n北京生命科学研究所邓兴旺实验室 n.基因表达数据对水稻35,970（81.9%）个预测基因的表达活性提供了实验依据，并检测到5,646个基因间区域的信号 簇，可能是目前算法和软件无法预测的新基因。通过与植物EST数据库比对发现其中近30%的序列与植物基因存在同源性的，并成功的克隆到了部分新基因的序 列。n.Tiling-array在每条染色体上的信号映射图谱，揭示了染色体的基因转录活性的分布与染色质的细胞学结构有着密切的联系。并依据tiling -array的在1号和4号染色体上的信号分布，通过FISH实验准确地确定了这两条染色体的常染色质区与以染色质区的边