动感地带作品MM论文

1、第七届云南省大中专学生课外学术科技作品竞赛参赛作品灰霉菌胞外大分子毒素分离及其是否为糖蛋白的定性鉴定摘要：灰霉菌（Botrytis cinerea）能侵染1000多种植物，危害多种粮食和经济作物，造成极大的经济损失。灰霉菌产生的毒素可导致植物萎蔫、褪绿和组织坏死等病症，而目前报道的灰霉菌毒素大多数为小分子物质，对灰霉菌分泌的大分子毒素了解不多。因此，分离纯化灰霉菌分泌的大分子毒素，鉴定其性质对于认识灰霉菌致病的分子机制具有重要意义。本研究利用过滤、离心、透析和冷冻干燥等方法对灰霉菌培养液中的大分子物质进行了提取分离，并对其进行了植物毒性鉴定。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对分离出来的大分子毒素进行了

2、纯化，回收蛋白条带，渗入植物叶片进行毒素鉴定，将有毒性的条带进行二次聚丙烯酰胺凝胶电泳并用高碘酸-希夫试剂进行染色鉴定是否为糖蛋白的蛋白性质。结果表明，灰霉菌胞外的大分子毒素为糖蛋白。关键词：灰霉菌；拟南芥；胞外毒素；糖蛋白Purification of High-Molecular Toxins from Culture of Botrytis cinerea and Their Glycoprotein Property IdentificationAbstract:Botrytis cinerea can infect more than 1000 species of plants.

3、And it harms a variety of food and economic crops, which could cause great economic loss. The toxic compounds produced by Botrytis cinerea can cause wilting, chlorosis and tissue necrosis etc, disease symptom in plants. Previous literature showed that a number of toxic metabolites have been isolated

4、 from Botrytis cinerea, but these toxins mostly are low molecule organic substances. The high-molecules toxins from Botrytis cinerea are poorly understood. The molecular mechanisms of pathogenicity by this fungal. In this study, the macromolecule compounds from culture of Botrytis cinerea were extra

5、cted and separated by using methods of filtration, centrifugal, freeze, dialysis and drying. The plant toxicity of these extracts was identified. Next, these toxinic compounds were purified using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The glycoprotein banding were recollected, and were infiltrat

6、ed into plant leaves to check their toxicity. Next,protein toxins are polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) again and these protein toxins are glycoprotein or not were checked with periodic acid-Schif(PAS) regent. The results showed that the macromolecular toxins produced by Botrytis cinerea are

7、 kinds of glycoprotein.Key words :Botrytis cinerea,;Arabidopsis thaliana; extracellular toxin; glycoprotein灰霉菌又名灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是灰霉病的病原物，属于半知菌亚门，丝孢目，淡色孢科，葡萄孢属是一种腐生型病原菌。近年来随着保护地蔬菜种植面积的扩大，其发生危害有严重的趋势，产量损失很大，特别是在生产田中或产后贮藏过程中蔓延速度快，灰霉病成为生产上一种世界性的主要病害1Williamson B. Tudzynski B. Tudzynski P. et al.

8、2007, Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology 8:561580.。灰霉菌属于坏死营养型病原菌，其侵染植物的方式存在两种可能，或是先分解寄主的表面细胞壁，以便更为有利地进入寄主细胞内寄生；或是一开始就分泌毒素，将周围的细胞杀死，然后以此作为生存的养分2Elad Y., Kohl J., Fokkema N.J. Control of infection and sporulation of Botrytis cinerea on bean and tomato by sapro

9、phytic yeasts. Phytopathology,1994,84(10):1193-1200。在植物病程中，植物病原菌产生的次生代谢产物统称为植物毒素，其中起决定作用的有毒物质主要包括非蛋白质氨基酸、生物碱、蛋白质毒素、不含氮毒素和生氰糖苷类毒素等五类3杨红玉,李湘,张一凡,李然.灰霉菌培养及其对拟南芥的侵染J.西南农业学报,2005,18(4): 431-434.。迄今已经分离出大约17种灰霉菌毒素，均为低分子量的有机化合物。我们的研究主要集中于灰霉菌分泌的大分子毒素，对其进行了分离和纯化，并对其是否为糖蛋白的蛋白性质进行了鉴定，这项研究对于了解灰霉菌产生哪些植物毒素以及他们是如何

10、危害植物的具有一定意义。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 灰霉菌（Botrytis cinerea）：由中国著名大学植物生理实验室提供；1.1.2 拟南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia生态型种子：由美国Lehle seeds公司提供；1.2 仪器设备恒温培养振荡箱：TS-100B Shaker incubator（上海天星实验仪器制造有限公司）、循环水式多用真空泵：SHB-（郑州长城科工贸有限公司）离心机：LD4-2A（北京医用离心机厂）、Eppendorf centrifuge 5415D高速冷冻离心机：Eppendorf centrifuge 5804 R

11、超净工作台：Air Tech（苏净集团安泰公司制造）磁力加热搅拌器：90-2型恒温磁力搅拌器电子天平：METTLER TOLEDO AL204（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）电热恒温水浴锅：HH·S11-2、HH·S21-4（北京长安科学仪器厂）透析袋：压平宽度（半周长）34mm，截留分子量14000，pH稳定范围5-9，5米/卷（USA）电泳设备：蛋白电泳槽Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System，电泳仪Power/pAC 300（Bio-Rad微型凝胶电泳系统）冰箱（Haier）、超低温冰箱368升立式（Czech Repub

12、lic JOUAN SA）滤膜滤器（milipore）：上海申越公司提供1.3 方法1.3.1 拟南芥培养 取适量的拟南芥种子于1.5ml的离心管中，加入1ml无菌水浸泡30分钟，然后分别用1ml95%酒精和0.1%HgCl消毒5分钟，无菌水洗涤5次。然后将消毒好的种子均匀散到灭过菌的MS培养基上，封口膜封口，标上日期，放到4度冰箱春化2天。将培养皿置于光照培养箱中（12h光照，22°C）培养直到长出2片真叶时将幼苗移栽到装有灭菌腐殖土的小花盆中，花盆放在托盘中，托盘内盛有水，用保鲜膜覆盖小花盆4天后揭开保鲜膜。温度保持在22左右，光照时间为12h/d。1.3.2 灰霉菌的培养将灰霉

13、菌菌种接到马铃薯培养基中22，黑暗，倒置培养10天，将马铃薯培养基上生长的灰霉菌接种于装有马铃薯培养液的三角瓶中，用棉塞封口置于180转/分振荡恒温培养箱中培养5天，温度保持在25-28。1.3.3 灰霉大分子毒素的提取将三角瓶中的培养液于4，5000r/min离心15分钟，收集上清液，用布氏漏斗、真空水循环泵和定性滤纸（快、中、慢各一次）抽滤上清液，滤出液-80冷冻干燥，然后用无菌水溶解，溶解液在4灭菌水中透析2天，其中每8h换一次水，截留分子量大于14,000Da的大分子物质,透析袋里的即为大分子毒素。1.3.4 大分子毒素的浓缩由于透析袋中存留大量的水分，我们采用两种方法去除：方法一：将

14、灰霉大分子毒素经滤膜滤器虑过后放到冷冻干燥仪冷冻干燥2天，得到浓缩的蛋白。方法二:用蔗糖包埋透析袋。1.3.5灰霉菌胞外大分子毒素的毒性鉴定我们采用针刺渗入法来进行胞外大分子毒素的毒素鉴定。首先选择生长到4周龄并且长势大致相同的健康的拟南芥植株两株，每株5片叶片，用沾有75% 酒精的棉球轻轻擦拭拟南芥叶片，进行表面消毒，然后用解剖针在一株拟南芥的两片大小大致相同的叶片上的相同位置各扎一个小孔，再用两个量程为10微升的微量注射器分别吸取10微升的胞外大分子毒素粗提液和10微升的无菌蒸馏水（作为对照），分别渗入到刚才扎有孔的叶片中，分别做上标记，另一株拟南芥也是进行相同的处理，接种后的拟南芥用黑布

15、盖住，黑暗培养一天后，转到光照培养室培养，温度控制在2224，光照时间12h/d，观察并记录照相。独立重复3次实验。1.3.6 灰霉菌胞外毒素蛋白的糖蛋白定性染色鉴定1.3.6.1 工作液配制（1）溶液A(丙烯酰胺储存液)：称30g丙烯酰胺和0.8g双丙烯酰胺用超纯水配成100ml,在通风橱内操作；（2）溶液B（4×分离缓冲液）即5mol/LTris-HCl（PH=8.8）：18.2gTris溶于40ml蒸馏水中，用盐酸调PH至8.8后加蒸馏水至100ml；(3)溶液C（4×堆积缓冲液）即5mol/LTris-HCl（PH=6.8）：6.0gTris溶于40ml蒸馏水中，用

16、盐酸调PH至8.8后加蒸馏水至100ml；（4）10%过硫酸铵；（5）电泳缓冲液（PH=8.8）：3gTris和14.4g甘氨酸加蒸馏水至1L；（6）5×样品缓冲液：5ml甘油，0.5ml 1%溴酚蓝，3.1ml 1mol/L Tris-HCl(PH=6.8)加蒸馏水至10ml。1.3.6.2 制胶步骤4汪家政,范明.蛋白质技术手册M.科学出版社,2000,8:111-122.清洗制胶板，烘干；组装凝胶模具。分离胶：将A液3.3ml、B液2.5ml、蒸馏水4.2ml在50ml三角瓶中混合，加入10%过硫酸铵50µl、TEMED 5µl，轻轻搅拌；用1000

17、1;l枪将液体沿隔片缓慢加入模具内，无气泡，距梳子齿约0.5cm；轻轻加入15mm水层，使凝胶表面平整；等待3060min（与小烧杯中的作对照），凝胶聚合，出现清晰界面，微微倾斜，检测凝胶是否聚合，吸尽覆盖在分离胶上的水。浓缩胶：将A液0.67ml、C液1.0ml、蒸馏水2.3ml在50ml三角瓶中混合。加入10%过硫酸铵30µl、TEMED 5µl，轻轻搅拌使其混合；用1000µl枪将浓缩胶加至分离胶上面，直至达玻璃板顶端；将梳子插入凝胶内，无气泡；等待30min凝胶聚合；拔出梳子放入电泳槽内；将电泳缓冲液加入内、外电泳槽中，使凝胶的上、下端均浸泡在缓冲液中，接

18、好Bio-Rad微型凝胶系统电极。检查：加样孔无气泡，凝胶底部无气泡，保持电流畅通；加样前用电泳缓冲液冲一下加样孔，去污物。1.3.6.3 上样取组分样品20µl于Eppendorf管中，加入5µl 5×样品缓冲液；水浴100加热210min；离心1s，有大量碎片则延长离心时间；用微量注射器将样品加入样品孔中，无气泡（蒸馏水、缓冲液冲洗注射器）；在最外侧加样孔中加入蛋白质分子量标准品；保持相同上样量10µl。1.3.6.4 电泳将电极插头与对应的电极相接，电流应流向阳极。电压调至200V（保持恒压）两块0.75mm胶，电流开始时100mA，结束时60mA

19、；（约5h）；关闭电源，从电极上拔掉电极插头；从电泳槽中取出凝胶玻璃板；小心移动两玻璃板之间的隔片，将隔片插入玻璃板一角。轻轻撬开，使凝胶在一板上。1.3.6.5 染色将其中一块凝胶固定液（50%乙醇）中固定30min,蒸馏水漂洗5次，再放入0.1%偏重亚硫酸钠+10mmol/L盐酸溶液中漂洗2次，每次10min,放入希夫试剂中避光染色1h,再放入0.1%偏重亚硫酸钠+10mmol/L盐酸溶液中避光漂洗1h,最后用0.5%偏重亚硫酸钠溶液漂洗3次，每次20min5张世雄,程立均.一种改进的糖蛋白染色鉴别方法的建立J.中国生物制品学杂志,2012,25(1):108-110. 另一块凝胶置考马斯

20、亮蓝染液中浸摇24h，弃去染液后，将凝胶在超纯水中漂洗数次；加入考马斯亮蓝脱色液（约50ml），震荡脱色3d，期间更换数次脱色液，直到背景颜色脱净为止。倒掉脱色液用超纯水清洗，继续摇荡至条带清楚为止。1.3.7 电泳凝胶上蛋白质的回收使用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒，将凝胶上清晰的蛋白质条带回收。产品组成：溶液A、溶液B、干粉、DTT（DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇）。试剂配制：使用前将干粉和DTT完全溶解于溶液A中，使用完后4保存，每次使用时30加热，混合好的溶液A用于实验操作。操作方法：用手术刀片将胶块中含有目的条带部分切下，放入1.5ml的离心管中，用研磨杵将离心管中的胶

21、体研磨成细小的碎片，加入400µl的溶液A，在室温条件下，脱色摇床上震荡过夜（1618小时），期间取出，偶尔震荡几次。室温12000rpm，离心15分钟，转移上清液到另外一个2ml的离心管中，加入2ml的4预冷的溶液B，混匀，4放置30分钟。室温12000rpm，离心15分钟，去除上清，再将离心管放置在通风橱中，待残留的液体挥发干净。选用缓冲液溶解沉淀的蛋白质，得到蛋白回收液。1.3.8 回收蛋白质的致病性检验蛋白质致病性检测方法：先用 75% 酒精对拟南芥叶片表面消毒，后采用针刺渗入接种法，即用微量注射器沿针刺创面将蛋白质渗入拟南芥叶片，每片叶子渗入10µl，以等量无蛋白

22、质条带的凝胶回收液渗入拟南芥叶片实验作为对照，观察拟南芥致病性。2 结果与分析2.1 灰霉菌胞外大分子物质粗提液的毒性鉴定我们采用针刺渗入法将灰霉菌胞外毒素粗提液渗入到拟南芥叶片内，在48小时后观察植物叶片的病症，结果如图2.1。图2.1 A为渗入无菌水的对照实验，48h后拟南芥叶片无明显变化；而图B为渗入胞外大分子粗提液48h，可见沿渗入部位出现黄白色“枯斑”和轻微的卷曲。 图2.1灰霉菌胞外大分子毒素粗提液对拟南芥叶片的影响A：为渗入无菌水；B：为渗入粗提液2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白条带的糖蛋白定性鉴定预实验希夫（Schiff）试剂能与醛基反应生成红色不溶性复合物，若PAGE胶染色后蛋

23、白质的条带若出现紫红色或者粉红色，则可以说明该蛋白质为糖蛋白；若不显色，则说明不是糖蛋白。为了摸索用希夫试剂染色的浓度、时间以及蔗糖包埋对糖蛋白定性鉴定的影响，我们选择了典型的糖蛋白辣根过氧化物酶，非糖蛋白但经过蔗糖包埋浓缩的牛血清蛋白质、未经蔗糖包埋的牛血清蛋白质、细胞色素C、溶菌酶等，用凝胶浓度为10%的SDS-PAGE进行电泳，然后用Schiff试剂染色进行染色。实验结果显示，只有辣根过氧化物酶被染上了紫红色，而其他的非糖蛋白细（胞色素C、溶菌酶和有或没有经过蔗糖包埋的牛血清蛋白等）都没有染上紫红色（图2.2所示）,说明Schiff试剂能够很好地指示糖蛋白，因此可以用来检测胞外毒素蛋白是

24、否是糖蛋白。54321图2.2 Schiff试剂对经聚丙烯酰胺电泳的不同蛋白质的染色泳道1：蔗糖包埋过的牛血清蛋白质；泳道2：未经蔗糖包埋的牛血清蛋白质；泳道3：细胞色素C；泳道4：辣根过氧化物酶；泳道5：溶菌酶。2.3 灰霉菌胞外毒素蛋白是否为糖蛋白的染色鉴定 我们采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，将经过分离的灰霉菌胞外毒素大分子进一步分离纯化。电泳开始上样前，在同一块凝胶上将毒素样品的点样重复一次，电泳结束后，将凝胶切开，得到两个重复胶块，然后分别用考马斯亮蓝染液和Schiff试剂进行染色。结果如图2.3所示，辣根过氧化物酶和经电泳分离的灰霉菌胞外大分子中有4条蛋白带被染成红色，而标准蛋白没有被染

25、成红色，说明这4条蛋白为糖蛋白。AB图2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳图图A： 希夫试剂染色；图B：考马斯亮蓝染色泳道1、2：大分子毒素分离样品经考马斯亮蓝染色，泳道3：辣根过氧化物酶，泳道4：标准蛋白，泳道5、6：大分子毒素分离样品经希夫试剂染色，泳道7：辣根过氧化物酶经希夫试剂染色。分子量的测定：电泳、染色结束后，测量蛋白质及示踪染料的迁移距离，并计算迁移率Rf值。Rf = 蛋白质的迁移距离/示踪染料的迁移距离（注：蛋白质的迁移距离是指从分离胶的起始位到蛋白质条带的前缘；示踪染料的迁移距离是从点样孔到蛋白质条带的前缘。）根据表2.3数据，以蛋白质分子量为纵坐标，Rf为横坐标绘图，得到一条直线；通

26、过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标准曲线上读出它的分子量，见图2.4。表2.3 蛋白质的迁移距离分子量（KDa） 20011697.266.444.3迁移率0.30.480.550.650.74 图2.4 分子量及其迁移距离标准曲线灰霉毒素蛋白被希夫试剂染成红色的四条条带的迁移率分别是0.54、0.57、0.62、0.64，根据y=-352.27x+296.42公式求得四条条带的蛋白分子量大约为106.2KD、95.6KD、78KD、71KD。2.4 毒素糖蛋白的回收使用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒，将前述的凝胶上前三条糖蛋白条带进行回收。试剂盒组成：溶液A、溶液B、干粉、DTT（DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇）。用手术刀片将胶块中前三条条带依次切下，分别放入1.5ml的离心管中，用研磨杵将离心管中的胶体研磨成细小的碎片，加入400µl的溶液A，在室温条件下，脱色摇床上震荡过夜（1618小时），期间取出，偶尔震荡几次。室温12000rpm，离心15分钟，转移上清液到另外一个2ml的离心管中，加入2ml的4预冷的溶液B，混匀，4放置30分钟。室温12000rpm，离心15分钟，去除上清，再将离心管放置在通风橱中，待残留的液体挥发干净。选用缓冲液溶解沉淀的蛋白质，得到蛋白回收液。将回收液经PAG