UV培训讲义PPT课件

1、内容提要基本原理 仪器基本结构 仪器校准 仪器定性测定仪器定量测定 仪器维护 第1页/共106页紫外-可见分光光度计使用领域 化学化工行业有机物的紫外光谱定性、定量检测、无机中配合物的测定、物化中催化动力学测定等。 环境领域主要用于水质检测，如：化学需氧量检测。 农、林、牧、渔业农药残留检测、作物成分检测、化肥检测、土壤成分检测、植物保护、植物检疫等。 医药行业药物含量测定等。 第2页/共106页紫外-可见分光光度计的特点 操作相对简单 费用少 分析速度快 灵敏度相对较高 其原理及结构是其它多种仪器的基础：荧光光谱仪、原荧光光谱仪、原子吸收分光光度计、电感耦合等离子体发射光谱仪、高效子吸收分光

2、光度计、电感耦合等离子体发射光谱仪、高效液相色谱仪等多种仪器均要用到单色器部分。液相色谱仪等多种仪器均要用到单色器部分。 用途广泛:紫外光谱仪是当今分析行业中应用最广泛的紫外光谱仪是当今分析行业中应用最广泛的四大仪器之首（其余三种为：四大仪器之首（其余三种为：HPLCHPLC、GCGC、原子吸收、原子吸收）。）。第3页/共106页紫外-可见分光光度法 它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光

3、度法。第4页/共106页 远紫外光区: 100-200 nm 近紫外光区: 200-380 nm 可见光区: 380-760 nm第5页/共106页紫外- -可见分光光度法基本原理第6页/共106页（1）转动能级间的能量差Er：0.0050.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；（2）振动能级的能量差Ev约为：0.05eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；（3）电子能级的能量差Ee较大120eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光谱或分子的电子光谱电子能级电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的间跃迁的同时总伴随有振动和转

4、动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。产生的若干谱线而呈现宽谱带。电子跃迁相关的能级跃迁的能量差第7页/共106页紫外光谱图示例第8页/共106页 入射光I0透射光I 光程透射率 T =II0 光源 检测器紫外分光光度计的基本原理第9页/共106页吸光度（A） 为了方便刻划物质吸收光的程度，引出吸光度吸光度这一参数。吸光度定义为：以10为底的透射率的负对数。NoImage10101001ALogLogITLogIT -第10页/共106页朗伯-比尔定律 吸光度与被测物质的性质、浓度，以及通过的光

5、程密切相关。当一束平行的单色光通过某一均匀溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的长度的乘积成正比。这被称为“朗伯比尔定律”。NoImageAcl第11页/共106页朗伯比尔定律成立的条件 单色光此条件主要决定于仪器。好的仪器能得到优良的单色光。决定能否得到优良的单色光的仪器器件主要是光栅和滤光片。此外仪器单色器部分的密封性也决定了单色光的纯度。 稀溶液此条件决定于操作人员本身。浓度过大可形成分子缔合，此时浓度与吸光度不成正比！切记：做紫外一定要配成稀溶液！第12页/共106页稀溶液浓溶液符合朗伯比尔定律不符合朗伯比尔定律！（无分子缔合现象）（有分子缔合现象）第13页/共106页“稀溶液”的标

6、准？ 吸光度在0.20.8（透光率（透光率15.863%）可视为理想的符合朗伯比尔定律的“稀溶液”。第14页/共106页在什么情况下误差最小？A=0.434 第15页/共106页岛津UV1800紫外可见分光光度计上海奥谱勒UV1902紫外可见分光光度计紫外-可见分光光度计第16页/共106页紫外-可见分光光度计的基本结构0.57光源单色器吸收池检测器信号处理及显示第17页/共106页1.单光束只有一束光通过检测池。一个检测器。要求光源和检测器具有很高的稳定性。适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描（现在有部分仪器通过软件设置可作扫描。）。简单，价廉。2.双光束 有两束光分

7、别通过两个检测池。可有一个检测器或两个检测器。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响。可进行快速全波段扫描。仪器复杂，价格较高。紫外分光光度计常用类型第18页/共106页单光束的基本结构（只一束单色光、一只比色皿、一只光电转换器）优点：结构简单、价格便宜缺点：光度准确度差、分析误差大，属低挡仪器。常见的仪器型号：国产上海精科72系列、75系列产品等；北分瑞利UV9600、上海美谱达UV1800。第19页/共106页双光束双检测器的基本结构（两束光、两只比色皿、两只光电转换器）优点：可消除光源不稳带来的误差、准确度好、精密度高。缺点： 结构复杂、价格较贵、要求两个检测器一致性好、信噪比不

8、如单光束(因一束光被分为了两束光，光强度减弱了)常见的仪器型号：进口紫外分光光度计一般均为双光束。如：岛津UV1800、日本分光V530；国产：上海奥谱勒UV1902、莱伯泰科UV2100 等。第20页/共106页双光束单检测器的基本结构（两束光、两只比色皿、一只光电转换器）缺点：结构复杂、 价格较高，信噪比不如单光束如美国的Lambda900、Lambda9、Cary6000、Cary500、Cary5 型日本的UV-2450、UV-3101、U-3400 型我国的T U-1901、TU-1900、UV-2100、UV-763 型 。优点：可消除光源不稳带来的误差、准确度好、精密度高。第21

9、页/共106页不同类型紫外分光光度计光路示意图不同类型紫外分光光度计光路示意图第22页/共106页单光束光路（Czerny-TurnerCzerny-Turner式光路式光路）光栅CT式光路是当今流行的光路设计。第23页/共106页这种光路属老式光路，上世纪上世纪8080年代流行的光路年代流行的光路。在紫外分光光度计中基本上属于淘汰型的光路淘汰型的光路。优点是结构紧凑，缺点是光线聚焦会存在一定的偏差。目前只有极少数仪器使用这一光路光栅第24页/共106页岛津UV2550光路 M1 光栅1光栅2这款仪器为岛津紫外分光光度计中的高档产品。有两个光栅。经两次分光后，光线的单色性非常高。杂散光降低到极

10、低值。仪器造价高。第25页/共106页单光束紫外分光光度计的辨别 单光束紫外仪一般有一个拉杆。检测参比池和样品池时，通过拉杆推到合适位置。 样品室只有一个光的通道。只有一个光的通道第26页/共106页双光束紫外分光光度计的辨别 双光束紫外仪没有拉杆。 样品室有两个光的通道。有两个光的通道第27页/共106页双光束光路（无锡科达无锡科达8500-II8500-II型型）光栅第28页/共106页思考： 1 1 下列光路是双光束还是单光束？下列光路是双光束还是单光束？ 2 2 单色器部分是单色器部分是C-TC-T式还是式还是LittrowLittrow式？式？第29页/共106页第30页/共106页

11、双光束紫外分光光度计如何实现光的分束？ 半反半透镜：一种方法是通过半反半透镜来分一种方法是通过半反半透镜来分束：在一个透镜上镀反光物质（一般是铝），束：在一个透镜上镀反光物质（一般是铝），使一半面积反光，一半面积透光。使一半面积反光，一半面积透光。 斩光器：另一种方法是通过斩光器来分束：即另一种方法是通过斩光器来分束：即一个扇形反光镜通过马达带动，以均匀速度转一个扇形反光镜通过马达带动，以均匀速度转动。光线遇到扇形镜时，光线被反射；光线没动。光线遇到扇形镜时，光线被反射；光线没遇到扇形束时，光射直射通过。遇到扇形束时，光射直射通过。第31页/共106页半反半透镜以透射镜制成。一般是石英材质。一

12、半镀铝，使之反射；一半不镀，使之透射。加工难度较大。第32页/共106页斩光器反射镜第33页/共106页搞清光路的意义 在紫外分光光度计中，光路决定了仪器的档次。 紫外分光光度仪价格相差很大，最低价者约5000元左右（只有可见光的仪器约2000元左右），最高价者可达60万元左右。光路及相应的构件是决定价格的至关重要因素！ 不同的光路适应于不同的检测要求。 不搞清光路，购买和使用仪器就会比较盲目，就可能会被供应商呼悠！第34页/共106页紫外分光光度计结构实例介绍 以U-2800型紫外分光光度计为例，介绍其整体实体结构。 U-2800为双光束型分光光度计。第35页/共106页U-2800内部结构

13、图（实体图）第36页/共106页第37页/共106页 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。使用寿命。 可见光区：可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3203202500 nm2500 nm。一般用溴钨灯。 紫外区：紫外区：氢、氘灯。发射185185400 nm400 nm的连续光谱。1. 光 源通常在350nm以下开氘灯，在350nm以上开钨灯。第38页/共106页氘灯（用于紫外区）卤钨灯（用于可见区）第39页/共106页氘灯 氘灯是利用气体放电原理

14、而获得连续光谱的光源。 氘灯工作原理：灯丝阴极发射的热电子在电场加速下向阳极运动与氘气分子实现非弹性碰撞而激发，从而辐射氘分子的连续光谱。利用其阳极光柱，因此强度很大。为避免阳极电弧光斑，在阳极垂直方向安装一个开有小孔的隔挡片以隔除杂光，使光自小孔发出。 波长范围一般为190400nm的连续光谱带。氘灯的使用波长范围一般为190360nm。在486.0、583.0及656.1nm三处各有一根特征谱线，经常被用来作为标定仪器的理论波长值 。第40页/共106页氘灯光谱第41页/共106页U2800的灯室构造氘灯钨灯反射镜第42页/共106页某品牌的紫外可见分光光度计灯室构造23第43页/共106

15、页 2.单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光：目前均用光栅光栅；老式仪器用棱镜来分光，已淘汰。 聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝。单色器非常重要！单色器性能的优劣决定了仪器档次的高低！第44页/共106页某品牌仪器的光路图（实图）第45页/共106页第46页/共106页 思考：为什么要有狭缝？狭缝氘灯钨灯凹面反射镜第47页/共106页此处为光栅，由马达带动转动，从而可调节不同的波长。光栅为核心精密部件，

16、不能用手摸光栅面，一摸就坏！第48页/共106页目前紫外分光光度计上使用的光栅一般为目前紫外分光光度计上使用的光栅一般为凹面闪耀光栅，看上去像一块普通的反光镜，凹面闪耀光栅，看上去像一块普通的反光镜，但其加工难度大，价值高。但其加工难度大，价值高。是分光计是最核心是分光计是最核心的光学部件！的光学部件！第49页/共106页光栅 光栅是用来分光的。也就是把一束复合光中某一波长的光集中起来，使之成为“纯的”单波长光。 目前所用的光栅通常为闪耀光栅。其光能损失小。 紫外分光光度计上的光栅一般是1200、1800条刻痕/mm。每mm长度上刻痕越多，分辨率越高，仪器越高档。当然，分辨率也与狭缝宽度相关。

17、 此外，在原子吸收分光光度计、电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）上也用到光栅，其光栅要求更高，通常是3600条、4200条刻痕/mm。第50页/共106页光栅原理（联系物理中的光学知识联系物理中的光学知识）第51页/共106页光栅调节不同波长是通过转动来实现的，而转动由马达控制。第52页/共106页光栅的保养 光栅怕灰尘：灰尘的沾污可严重影响刻痕，从而影响分辨率。但如果光栅上沾了灰尘，切忌去用手摸或用其它材料擦拭，一擦就坏！ 有机溶剂、湿气对光栅也有一定的影响。 光栅置强光下，也会产生老化现象（光栅是镀铝的）。因此实验过程中要注意不要长时间让强光照射光栅。第53页/共106页滤光片第54页/

18、共106页滤光片 滤光片的作用是滤去杂散光，让光更“纯”。 一般用紫、蓝、黄、绿、红五种滤光片，分别滤去不同波长段的杂散光。第55页/共106页从滤光片出来的光半反半透镜第56页/共106页入射狭缝与出射狭缝 在分光装置中，一般有入射与出射两个狭缝。狭缝的意义在于使光线更集中，同时也可减少杂散光的影响。 低档仪器狭缝是固定的，中高档仪器大部分狭缝是可调的。 狭缝宽，光就强，但同时杂散光也会增多；狭缝窄，光就弱，但杂散光低。因此仪器要有合适的狭缝。 衡量狭缝是否合适采用的指标是单色光的带宽（Band width ）。狭缝窄，带宽就窄；狭缝宽，带宽就宽。因此可以通过调节狭缝来调节带宽。最常用的带宽

19、为2nm。第57页/共106页带宽 带宽是指从单色器射出的单色光谱线强度轮廓曲 线的二分之一高度处的谱带宽度。 带宽用来表征仪器的分辨率。带宽越窄，分辨率越高；反之亦然。光强带宽第58页/共106页狭缝宽度与光谱带宽的关系 nm带宽 1nm带宽 2 nm带宽 5 nm第59页/共106页狭缝选择的实现 在紫外分光光度计中，事实上是将一系列不同宽度的狭缝镂刻在一个圆盘上，通过马达带动圆盘转动，从而调节不同的狭缝。第60页/共106页必须澄清一种错误的说法关于狭缝 有些仪器上有调节狭缝的功能，标明：狭缝（Slit）1nm、2nm、5nm、8nm等。这一说法是严重的错误！ 事实上是：调节狭缝使带宽为

20、1nm、2nm、5nm、8nm等。 狭缝宽度一般为几毫米。但“狭缝宽度”不能作为分辨率的指标。具有本质意义的是由调节狭缝而引起的带宽的变化。 建议以后不提狭缝宽度，只提带宽。以免混淆。第61页/共106页3. 样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。紫外光区：必须用石英比色皿。可见光区：可用玻璃玻璃比色皿，亦可用石英石英比色皿。生物实验中通常还有微量比色皿。常量微量第62页/共106页石英与玻璃的区别第63页/共106页如何辨别石英与玻璃比色皿？ 在外观上一般无差别。 厂家一般会在石英上标上“Q”或“S”，在玻璃上标上“G”或者不标记。 在不清楚的情况下，可通过测试紫外区

21、的吸收来辨别。在紫外区有强吸收的是玻璃，几乎无吸收的是石英。第64页/共106页比色池光程长短对测定的意义 紫外分光光度计测定的是光通过比色池后，透射率的变化值。 在同一种溶液中，光通过的光程越长，吸收越多。比色池常见的是1cm，也有5cm、10cm的。越长越灵敏。第65页/共106页4. 4. 检测器检测器n利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。第66页/共106页硅光电池第67页/共106页光电倍增管第68页/共106页5. 结果显示记录系统第69页/共106页紫外谱图显示第70页/共106页固体紫外简介 测定固体的紫外光谱，必须更换相应的附

22、件。 固体的紫外光谱通常是根据漫反射原理。 附件一般为积分球。第71页/共106页积分球：一般是将一根内径为60-150毫米的铝棒切成两半，然后将其挖成空心球，在球的内壁上涂上硫酸钡或熏上二氧化镁而制成的。根据样品反射面积的不同，积分球的大小也不相同。第72页/共106页 上图是用于反射光谱测定的积分球原理图。从单色器过来的双光束通过两个窗口进入积分球，照射在样品及参比上，反射光进入光电倍增管，后者交互测定样品及参比的漫反射。第73页/共106页附件的更换 先拧开右上图所示的螺丝，再抽出附件。注意装上时卡口一定要卡好第74页/共106页积分球导线的连接导线按上图方式连接第75页/共106页积分

23、球的测样板NoImage 标准板和样品板装样后应尽量与板表面齐平，保持样品表面光滑且无杂物污染。标准板用BaSO4装满，样品板可用待测样品填满也可以先用BaSO4填然后再将BaSO4表面用样品覆盖。第76页/共106页 仪器的检定仪器的检定 吸收池的配对波长的校准吸收度或透光率校准杂散光的测试第77页/共106页波长的校准波长的准确严重影响到测试结果，因此，新进仪器一定要校准波长，在使用过程中，也要经常校准波长。校准波长的原理：氘灯的特征吸收峰：在656.1 nm处有一个尖锐的吸收峰，以此作为标准。一般中高档紫外分光光度计均以为校准方法，且开机即进行自检。特定物质的吸收峰：常用的是钬玻璃（紫外

24、-可见区）及镨钕玻璃（只用于可见区）。此法是低档仪器的基本选择，也可在中高档仪器上验证。第78页/共106页第79页/共106页钬玻璃第80页/共106页钬玻璃特征谱线第81页/共106页杂散光检验杂散光越少，光的单色性越好。杂散光是衡量仪器性能的重要指标。高档的仪器杂散光越低。利用硝酸钠、碘化钠的特性可进行杂散光的检测。第82页/共106页杂散光检验步骤（1）用浓度为10g/L的NaI水溶液，1cm石英吸收 池，蒸 馏水作参比，于220nm波长处测量溶液的透光率。 （2）用浓度为50g/LNaNO2水溶液，1cm石英吸收池，蒸馏水作参比，于340nm波长处测量溶液的透光率。其透光率应符合下表

25、中的规定（注意：检查杂散光应在校正波长以后进行）。 第83页/共106页u220nm处的杂散光测试：10g/L的NaI 水溶液：特性为：0-258nm 处不透光，而从258nm开始，透光率可立即达到90%以上，并且上升坡度很陡。可检测220nm的杂散光（此处NaI溶液本应不透光，如果有透过的，测为杂散光）。u340nm 处的杂散光测试：采用50g/L 的NaNO2 水溶液：特性为：0-385nm 处不透光，而从385nm 处开始，透光率可达90%以上，并且上升坡度很陡。可检测340nm的杂散光（此处NaNO2溶液本应不透光，如果有透过的，测为杂散光）。第84页/共106页用NaNO2检测杂散光

26、图谱第85页/共106页吸收池的配对 如果参比池和样品池的空池的吸光度不一样，将会对结果产生影响。 出厂前一般厂家对吸收池进行了配对。 一般两个池的透光率相差不到1%认为合格。 实验过程中要注意配对使用，不要乱搭配。第86页/共106页吸光度的校正 用重铬酸钾（K2CrO4）标准溶液来校正吸光度的标度。因重铬酸钾有多个吸收峰，且溶液稳定，适合作标准液。 方法：将0.0400gK2CrO4溶解于1L的0.05molL-1KOH溶液中，在1cm光程的吸收池中，在25oC时用不同波长测得的吸光度值与标准值比较。第87页/共106页铬酸钾溶液的吸光度第88页/共106页 紫外光谱的定性作用二、 定性鉴

27、别对比法：比较样品化合物的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征；或与文献所载的化合物的标准谱图进行核对。同一物质有相同吸收光谱图，反之不一定是同一物质。但总的来说，紫外光谱定性鉴别结构的能力相对较弱。一、 以光谱特征对结构作粗略判断三、 纯度检查第89页/共106页（1）200-400nm 无吸收峰。饱和化合物(非Br/I/NH2取代），单烯/炔。（2） 270-350 nm有吸收峰（=10-100）n* 跃迁产生的R 带，C=O/C=N。（3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰（=200-2000），芳环的特征 吸收（具有精细结构的B带）。（4） 200-250 nm有强吸收峰（1

28、04），表明含有一个共轭体系（K）带。 紫外光谱可获得的结构信息第90页/共106页1、对比吸收光谱特征数据：max、 min、 sh不同基团化合物可能有相同的max值，但max有明显差别；有相同吸光基团同系物，其max、 max值接近 ，但分子量不同，E1% 1cm差别大。 max：化合物特性参数，可作为定性依据； 标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图 The sadtler standard spectra ,Ultraviolet 定性鉴别第91页/共106页三、纯度检查1、杂质检查：有杂质时，吸收光谱变形。2、杂质限量检查： 以某一波长吸光度值表示； 以峰谷吸光度比值表示。

29、但紫外光谱进行纯度检测的能力相对较弱。第92页/共106页 定量测定 定量测定: 根据朗伯-比尔定律，具有紫外可见吸收的物质的溶液在一定范围内，其浓度与吸光度成正比，测定吸光度，即可 求出浓度。定量测定分为：单组份定量和多组份定量定量分析单组份定量：标准曲线法、标准对照法和吸光系数法多组份定量：测量依据是吸光度的加和性，采用计量法测定第93页/共106页配制一系列不同浓度的标准溶液，在同一条件下分别测定吸光度，然后以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制A-C关系曲线。 根据测得样品吸光度，从标准曲线中求得样品溶液浓度，最后 计算含量。标准曲线（工作曲线）法第94页/共106页溶液一定要稀：标准

30、溶液的吸光度应尽量控制在0.20.8之间。样品溶液的吸光度控制在0.40.5最好。但无论如何要在0.20.8。配标准溶液应首先配一个母液（贮备液），其余不同浓度的标液一次性由这个母液中移取来配制。 标准溶液要取56 个点 标准曲线一般不要强制过原点，也就是说应有截距。因为一般空白溶液会略有本底吸收。 标准曲线的相关系数不应低于0.9990。即：R0.9990。注意，不是R2！（ R2表示决定系数，不是相关系数！）紫外标准曲线的要点第95页/共106页标准曲线第96页/共106页强制过原点，不妥！第97页/共106页紫外分光光度计的使用注意事项 仪器调试 测定注意事项第98页/共106页仪器调试 仪器购进之后应进行验收。包括波长准确度、精密度、杂散光等各方面的调试。 在正常使用过程中，开机后应耐心等待其自检通过。一般在开机3