显微镜技术及其功能配置应注意的若干问题

1、显微镜技术及其功能配置应注意的若干问题王雁崔泽实 *中国医科大学 沈阳 110001光学显微镜较为广泛应用于医学实验室， 随着近代光学技术的发展及微电子、 计算机等 技术的融合， 更赋予这一传统仪器技术以新的生命力。 在掌握必要的显微镜及其各种镜检方 法的理论知识基础上， 精确进行调试、 校准和定期维护， 对保证显微镜技术的有效利用及观 测质量甚为重要。1 安装与维护安装与维护是保证显微镜正常使用的基础条件。 显微镜应安置在无尘、 无振动、 无化学 腐蚀性暴露、无过度光投照散射、相对湿度低于60 的实验室内。无尘是安装使用光学检测仪器的特定要素1，尤其是进行暗场、 DIC 相差、荧光等镜检时。

2、 除要保持室内清洁外， 重在对显微镜施实时养护。 清洁显微镜光学器件先可用吹气风球 吹朔掉表面的灰尘颗粒，随之用专用擦镜纸蘸适量擦镜液（乙醚和乙醇7:3配制的混合液）由内向外螺旋跟进擦拭， 而后用干纸擦，再用吹风球吹干；对40X物镜前透镜要使用质地 较软的木牙签或类似物体磨钝尖端包上至少两层擦镜纸蘸擦镜液轻擦，不能用坚硬的竹牙 签， 以免牙签透过擦镜纸划伤透镜面。 使用油镜后要立即湿擦两次， 同时检查相邻的其它倍 率物镜是否在转换镜头时沾染上镜油， 如有一并擦拭之。 但注意不是所有光学部件都可如此 擦拭，对镀有特殊光学涂层的偏光镜检的起偏镜及检偏镜、 DIC 棱镜、荧光激发发射滤光片 组件等，

3、 平时要常用吹风球吹朔， 一旦沾染最好涂液态胶类物质干后揭去粘除污染物。 不能 用有机溶剂（如高浓度酒精）擦拭镜体。无振动体现两个涵义。一是安装位置远离振动源，安装台面水平、稳定、无振动，必要 时配置专用防震台， 配套计算机最好不要与显微镜放在一个台面上且两台间要留有空隙以免 联动。二是操作过程无振动，特别是在镜像采集的曝光时间内、显微操作、显微切割等精密 环节 2 。除外荧光镜检， 控制室内的光照度和方向非常重要， 照明要均匀避免过度炫光。 光照不 能刺激人眼，也不能直接投照显微镜的光路器件，把显微镜临窗安置是不甚合适的。较长时间不用的可拆卸光学部件要放入干燥罐中保存， 并定期更换吸潮剂。

4、在湿度较高 季节，室内最好安装除湿机并及时倒掉水箱内的水。2 调整与校正主要是显微镜光学器件的调整、校准及其光学参数设置。2.1 照明光源灯丝对中对没有预定灯丝中心的显微镜需要在更换灯泡或搬动显微镜后进行此项调节。方法是缩小视场光阑， 在视场光阑处放置乳白磨砂滤光片或一块硫酸纸， 可看到灯丝像和缩为点状的视场光阑像呈现。利用灯箱外方的三个调节螺杆进行调节操作， 其中一个调整灯泡的聚焦直到灯丝像清晰可见，如点状视场光阑 像不在灯丝中央，则用其它两个螺杆做上下、左右调整，直到灯 丝完全调至中央为止，见图 1。22聚光镜光（合）轴调节聚光镜光轴偏移产生的问题是视场照明不均，因而此项操作要纳入显微镜的

5、定期校准规程。在明场下，用10 X物镜观察标本并完成调焦；将视场光阑尽量缩小、聚光镜孔径光阑开至最大，在视场内 可见到视场光阑的轮廊像（视场光阑像不清晰，可稍微 调节聚光镜的升降螺旋）;如后者不在视场中央， 则交替 旋调聚光镜外侧的两个调中螺杆将其调至中央部分，而 后逐渐地开大视场光阑，能看到光阑向视场周缘均匀展开直至视场光阑的多角轮廓像完全与视场边缘形成内接， 表明聚光镜与显微镜光路达到合轴。合轴后再略微开大视场光阑， 使轮2。注意不要忘廓像刚好处于视场外切或稍大一些，这样即适于作镜检观察，调节过程见图1.25mm处，如聚光镜低于此实际上当用10 X物镜观察记将聚光镜升至原位，其透镜距镜台平

6、面0.1mm,焦点位于上方 位将改变焦点并导致部分光斜照标本产生过多衍射光影响分辨率。倒置显微镜要根据聚光镜标定的工作距离调节聚光镜的位置， 到清晰的视场光阑时应当是合适的距离。2.3视场光阑调节为获得更好的镜像反差，应尽量屏蔽多余 的杂散光进入观测镜场或成像区域，在经目镜配合不同倍物镜进行观测时， 可调节视场光阑 像对应目镜视场形成外切（图3左）；在显微摄影或数字CCD成像时，可根据取景框和CCD成像区域再适当缩小视场光阑（图3右），但不要缩过造成照片切角。使用油镜时也可适当2.4 聚光镜数值孔径的设置首先，配置聚光镜的数值孔径 高倍细微镜检时有必要在顶端加油。缩小调节。（numeric a

7、perture, NA）范围应与物镜的 NA值基本相等,孔径聚光镜的作用是对应物镜数值孔径提供有效的聚焦投射光，如果设置聚光镜的 NA大于物镜NA则一部分光浪费，而过小于物镜NA投射光不足且由于出射角改变使一部分光斜照射标本呈现衍射镜像，两者均会降低镜像的分辨率。因此,应遵循一定的对应设置原则，经验值是镜检观察时为80100%，摄影时为获得较合适的反差和景深建议设置在 6080%或7080%。这意味着每转换一种倍率的物镜时，都要根据其NA对聚光镜的NA做出对应设置2，这样才能保证镜检质量，实际中还可根据标本薄厚、染 色深浅进行细调。2.5 覆盖差校正标准盖玻片厚度0.17mm、载玻片1.0mm

8、，由于采用不符合标准的盖玻片或载玻片加之切片、封片剂薄厚不均会产生覆盖差，影响较大NA物镜的镜像质量。为校正覆盖差，在40X、60 x或20 x干系物镜上设计有覆盖差校正环(correction collar, CC)，校正范围一般在0.110.23mm，长工作距离物镜可至2.0mm。应当精细掌握CC的调节要领，不然反而会带来 麻烦， 特别是当前一个实验者做了校正而下一个实验者的样片覆盖差不一致时。方法是， 先选调CC将0.17数值标线对准定位刻线，观察镜像是否能做到调焦清晰，如不很清晰则分别 向左右方向旋调CC环直至镜像达最佳，且要坚持每当更换标本时均应完成覆盖差校正调节 才能保证镜检质量。

9、2.6 光源电压目前钨卤灯透射光照明主要有6V/20W、6V/30W和12V/100W三种(50W灯源已少见)，显微镜通过调节电压控制其功率。在常规镜检，可根据标本的薄厚、物像层次(对光的吸收 情况)以及色温来调设电压值，如镜像过亮刺眼可加中密度(neutral density, N或ND)滤光片。值得留意的是在显微摄影时， 需根据实际测得的色温值调节电压达到胶片所要求的色温(如日光型胶片5,5006,000K°或6,500K°,对应电压在912V)，一旦设定则不能随意再改变 电压，只能通过加 ND 滤光片调节而不影响色温。2.7 屈光度调节此项操作很容易被忽略以致实验者眼

10、疲劳， 实际上临检级显微镜的目镜筒大多配置有屈 光度调节机制。 生产厂建议调节方法各异， 但如果配置的物镜齐焦常用操作步骤是， 先调整 好瞳距， 用右侧目镜观察完成对焦， 而后改用左测目镜观察调节装有的屈光度校正环直至调 焦清晰；或先用40X物镜完成镜像对焦，再改用4 x物镜用左眼观察，同时旋转目镜筒上的屈光度校正环，直到聚焦镜像最佳。2.8 常用镜检法的调置重点讨论以下镜检法操作过程中常易疏漏的调置环节。2.8.1 明场(bright field, BF )定期进行聚光镜中心调整，实时进行聚光镜与物镜NA的对应数值调设。清洁盖玻片、载玻片，确保没有手印、沾染物。使用油镜时，调焦或移动视野要慢

11、些以维持浸油形成的表 面张力保证对焦和孔镜角稳定，兼做荧光观察的物镜最好统一用无荧光油2.8.2 暗场(dark field, DF)暗场镜检首先是利用暗场聚光镜的环状裂隙和凹面镜制造有序的斜射光，因此必须调整好光轴对中。 要清洁物镜的前透镜等光学器件和标本片， 载玻片不能太厚， 否则聚光镜的焦 点落到被检物体焦面以外。2.8.3 相差(phase contrast, PH)镜检前，要用调中镜(centering telescope, CT)逐一检查物镜的相板与所对应的聚光镜 相差环是否达到光学共轭，即聚光镜相差环环状光阑像的透明圈与物镜相板共轭面完全吻 合，才能达到理想的相差效果3,4。一般

12、情况下，聚光镜的孔径光阑应适当开大或设置在标定PH位。切片控制在510m厚度，封片剂要均匀。2.8.4 DIC 相差(differential interference contrast, DIC )标本或器皿要洁净无尘，必须事先调整好起偏镜、检偏镜和DIC棱镜的设置，用CT镜检测出现清晰的干涉条纹。但兼做荧光观察时，要把 损伤DIC器件的光学镀膜。塑料器皿最好选择 contrast, HMC )。2.8.5荧光(fluorescence, FL)需遵循说明书熟练掌握荧光光源的灯丝对中 方法，当荧光照明不均或亮度不佳时进行检查调 整，特别是在移动了荧光显微镜位置、过度振动、 误触碰了聚光和对中

13、调节螺杆等情形后。在研究 室荧光装置最好在视场光阑的基础上加配置孔径 光阑调节，并定期检查荧光激发光路中心，根据 标本情况调节孔径光阑和光路聚焦。汞灯在开启约DIC器件移出光路，以避免较强的激发光Hoffman 调制相差( Hoffman modulation5分钟后达到最佳弧光照明亮度，一旦关闭必须等1520分钟后方可再次开启(待汞蒸汽复至常态)3 必要光学器件的选择及功能配置即便是在同一级别的显微镜，针对不同应用目的合理地选配必要的光学器件将直接关系到观测功能和成像质量。因此，显微镜的功能配置方案应由实验者制定，不能单方面由供应商提供更不能简单地接受所谓标准套”。3.1物镜物镜是光学显微镜

14、的最核心器件，其质量优劣和功能将决定显微镜的总体水准。选择物镜应考虑的主要因素是：物镜等级：满足实验室常规镜检最低限度是平场消色差(plan achromatic )，有条件或特定要求时可配置平场复消色差(plan apoachromatic)或部分选配，特殊观测要配专用物镜，如无盖片、荧光、相差或荧光相差兼用、偏光、Hoffman调制相差等。NA值：物镜NA值决定着镜像分辨率(光学显微镜分辨率=0.61冷/NA )和亮度。因此，研究用显微镜(特别是配置数字CCD成像装置时)优选高 NA值物镜，以减低模糊圈效应(见图4)，最大限度地提升光学分辨率。而为解决高倍干镜镜检覆盖差问题可选带CC环的物

15、镜。工作距离：除倒置观测要考虑物镜的工作距离外，该参数对正置镜检也很重要，特别是 当标本较厚、层次复杂时为获得较理想的景深，但可能会损失一定的分辨率。3.2目镜根据光学显微镜的成像原理，有效放大=物镜NA X 5001000，此范围以外为无效放大6。因此，多数情况下应配置国际标准推荐的10X目镜。也提示在进行显微摄影时要在有效放大倍率内首选低倍摄影目镜，而通过提高物镜倍率来获得高倍镜像，放大照片或数字 CCD成像时采用电子放大也应参考有效放大原则。在配置10X目镜时视场数(field number, FN )至少应是FN20，研究级常为FN22 ;在病 理诊断和形态学计数时可配置FN26.5的

16、超广场目镜，在一个镜野下获得更多的图像信息。3.3聚光镜明场观察，Abbe聚光镜适于最基本的常规镜检，兼顾低倍可选配摇出式聚光镜，但两者的NA值是0.9，若追求较高分辨率的细微镜像观察，还可选用消色差/消球差聚光镜(NA1.4 )。通用聚光镜可兼明场、暗场相差或DIC，多功能配置可选用。倒置显微镜的长工作距离和超长工作距离聚光镜的选择要考虑观察器皿的厚度以及可配置的需求功能。3.4滤光片以下滤光片的配置和作用不可忽视：吸热滤光片：常为乳白色磨砂玻片，置于光源的出射口， 防止光源过热辐射损坏光学器件的精密镀膜，另可吸收杂散光使光线变得均一柔和，切忌不能随意移出光路。色温平衡滤光片：蓝色，转换光源

17、色温。根据显微摄影时胶片类型有和灯光型两种，常 用为日光型。色温补偿(color compensation , CC)滤光片：依据光的原色及互补色原理，纠正某种 镜像偏色(如组化染色)，见表1。表1偏色的互补色纠正减去所偏的颜色需要加用补偿滤色镜的颜色和缩写蓝黄CCY青红CCR绿品红CCM黄蓝CCB红青CCC品红绿CCG绿色滤光片：特别用于黑白摄影和相差观测，以纠正物镜像差缺陷，增加绿色波长，使 物镜色差纠正到最佳；另外，HE对绿色吸收能力强，增加黑白照片反差。中性密度滤光片：按一定百分比吸收减弱光量，但并不改变色温，常用规格应搭配。特殊目的滤光片：专用于酶染色、抗原-抗体反应等。3.5 光学接口(适配器)最重要的参数是数字 CCD 接口的光学倍率要与 CCD 芯片尺寸(成像面积又称靶面) 配套。参考文献1 舍英, 伊力奇 , 呼和巴特尔 . 现代光学显微镜 . 科学出版社， 19972 郭丽洁 , 崔泽实 . 医学实验室的光学显微镜图像记录技术-显微照相术，中国医学装备,2007,4(4):40-433 David L.Spector, Robe