单一和多重步骤质谱分析之高正确性

1、Modular Mass Spectrometric Tool for Analysis of Composition and Phosphorylation of Protein Complexes Abstract 單一和多重步驟質譜分析之高正確性 、靈敏度和速度的結合加強 有關複雜生物樣品全套的細部資訊收集。為了完成這些性質，我們在 一個模組的質譜工具上 ，組合兩種高效能的協助分析物去吸附物的雷 射離子化(MALDI)質量分析儀，而且應用這工具針對蛋白質錯合物的 分析組成成份和後平移調整。在一個樣品的研究上，顯示出啤酒酵母 菌的研究，在它的組成成份上，後期促使錯合物(APC)並且解釋磷酸

2、化作用的位置。一般而言，我們所描述的模組觀念針對裝配質譜操作 複雜的生物樣品全套分析，將兩種 MALDI和ESI離子來源成為有力 的質譜工具，是有用的。Introduction最近這幾年，生物樣品的質譜(MS)分析已經逐漸增加承擔複雜蛋 白質混合物的直接分析，經常有不同組成的目標需要精細的特性描 述。此一趨勢傾向於曾經更大的樣品複雜度，藉由有力的 MS 工具快 速發展，已經能夠使用和轉換。最近的 MS 的一般特徵是大部份是利 用不同的強度和性質，組合一連串的多種質量分析儀，結果在串聯的 儀器上，藉由各別的組成，擁有難以達成的能力(圖一 A)。例如： triple quadrupole (QQQ

3、) 、 Quadrupole/Time-of-flight (QTOF) 、 Quadrupole/Ion trap (QTRAP)、Time-of-flight/Time-of-flight (TOF-TOF) 等多種一前一後的 MS 已經被證明對分析研究是有效力的工具。串聯的儀器能夠組合高質量的準確性和高速的測量 ，大大的使得 分析複雜的混合物變容易。例如，TOF、FT-ICR和Orbitrap質量分析 儀成為IT等的增加，經由多重步驗的 MSn分析，已經大大的增加測 量的正確性。兩種類型 MS 的物理整合，結合它們最好的效能，在選 擇離子上，前離子選擇步驟和後 MSn 實驗之間，提供快速

4、連結。這 樣的選擇是便利的，速度與正確性對於分析的成功都是重要的，照原 樣，例如： MS 直接與一個線上的 HPLC 系統串聯。在串聯多重 MS 的物理聯結有一些不利條件。針對不同 MS 和一 連串儀器的操作模式中，最好的操作態狀有極大的不同，為了其中一 部 MS 有最好的效能，需要犠牲別的機器，就會產生需要妥協的問 題。針對這個問題 ，分離混合儀器中的部份零件是解決的方法 。當然， 一個 MS 模組工具從幾種 MS 被組合，沒有物理結合他們在一部儀器 上。幾種 MS 被利用作為分離模組，優化分析的每一個特殊類型，和 應用反過來提取綜合有關樣品以數據依賴方式的訊息 。那些收集到的 資料很快的利

5、用電腦分析，基於分析資料的結果 (是在先前的儀器和 經過儀器到下一個樣品)，產生一組指示 。在如此的一個模組工具中，Tandem Mass Spectrometerlor Source LSt Or MALD)LM1D1XI1Modular Spectrometer分析的理論速度僅限制在樣品分析的速度 (就是從這一台MS到另一 台，樣品的殘留部份在不同的儀器和轉移的速度)。computerMau Spttctronwler *1Spetrcrnstwr #2computespfrcirnrrurprMNQLMUliMSame MALM targetarSplitrflOWdvlayESIFig

6、ure L ithcmatic diagrams M (A： j tondem rias spectrometer jnd B o modular mjs spectrometer. eJoi :10 1371 /joti in rtl pOn OOO0358 QOOI基於上述觀念的一個模組儀器簡圖舉例如圖一B，多重的MALDI儀器能夠簡單的結合成一個系統，利用一個可交換的MALDI 目標板。類似的，多重的ESI-MS能夠組合藉由分流技術引導延遲， 介於在不同儀器的離子來源樣品到達時間。在這個例子，時間延遲是 大於上游儀器的使用率，所以數據依賴指示能夠產生和傳達到下游儀這個觀今已經被利用在組合

7、高解析度、高質量準確度MALDI-QqTOF儀器和高速度、高靈敏度的 MALDI-IT質譜。這個組合證明 了非常有用，對於了解很多有挑戰性的生物問題。最初利用組合儀器 的研究，是用於在內部的調整儀器。然而，最近類似的質譜儀器之商 業介紹已經公開發展前途，可以在任何實驗室發展這種方法。這份報告描述一個質譜的模組工具，以兩個MALDI質譜儀為基礎，是代理的 TOF (PerkinElmer)和 vMALDI-LTQ (Thermo Electron)。 我們證明此工具在蛋白質錯合物組成研究上的應用和鑑定啤酒酵母 菌後期促使錯合物(APC)的下面單元的磷酸化位置。Result質譜儀的結合效能在發展我

8、們結合質譜系統的第一步驟，我們設計一個磁性的 MALDI目標，這可以交換代理的 TOF和vMALDI-IT 儀器。這個目 標允許單一樣品利用兩台儀器的連續分析（見方法部份）。我們在單 一 10-15莫耳級的儀器，分析一個已知六個 peptide的混合物，評估我 們組合質譜系統的效能。分析的第一步驟是應用代理的TOF儀器，快速收集高解析度、高質量準確度的MS資料。代理的TOF質譜儀是一台一次使用的儀器，針對單一步驟的MS光譜快速測量。圖二A顯示peptide混合物的MS光譜，在三十秒內獲得。我們至少得到六 個peak，訊號對雜訊的比例超過1.5:1。被觀察到的解析度大於10,000,能夠清楚決定

9、peptide同位素的分佈。重要地，質量準確度 是在ppm的範圍內，甚至為了統計微弱的訊號。只有微小量的樣品 在分析的第一步驟被消耗。A prOTOF MALDI： MS 1 femtomole. 30Au 針匚£u-904 4721«|904刚材1363 72A 材1363 734 材1B72 922(*)1672 916 (ct34m 65S 4 曰343 651 (c)1000B vMALDt-LTQ MS/MS：100 904.472 m/t 2 sec，.-ysPPGFSPFR1955.022 m/z 2sec3500VH HQ KLVT FAEWGSNK

10、6;T « 10 i i 13 U U8勿片把yJ L i . Jt 1 jl. ib.J300500700133724 mil 2 sec100RPKPOQ F F GLMtOj-N H2900 mJ JSOO100014001000 mn2980.595 mti 3 S«CSrSMO2)EHFRW(0iGKPVGKKRRPVKVYP4001200167； 922 rn/z 2 secpELYENKPRRPYIL120016M2000240034M.65B nJ? 3F VN0iHLC(O3GSHWEAL LVC(O3)GE RGF FYTPKA 人.£J &#

11、163;»?3T9iai7lS12u 如10001S002000300Q価Figure Z Combined perfonncinces of a prOTOF and d vMALDl LTQ mass spectrometers as one modular tool. (A) prOTOF MALDI*MS spectrum d( a 1 fefntamole mixture df six peptides, obtained in 30 seconds of spectrum acqukitiQri tirw. The measurements of th琴 m/j valu

12、es* of tlhe peptides were pErformed using an external instiumenrt clibrution. The rnonDisotopic resolution for the detected bn peaks as well as the 匚eilcLjIated 杞I iind the experimentcil fe) m/i 四 lu劭sbiown. Tihe peptides are bradykinin (fragment 2-9: PPGF5PFR, rn/z = 904,468. thTOretical valued Sub

13、stance P(RPKPQQFFGLM INH2. m/z - 1347.736). neurotensin (pELYENKPRRPYIL. m/z = 1672.91 fih amyloid -pratein (fragmEnt H2-2B: VHHIQKLVFFAEDVGSNK. irVk = W55.O Hr ACTH ($¥5M EHFRWGKPVGKK RRPVKW P. m/z=2932-588). arxl B chain of oxidzedl irtsul in. (FVNQHLC(O3)G5H LVEAL¥IV(O3)G ERGF- FYTPKA,

14、m/z - 3494.6S 1). (Bt vMALDI-LTQ MS/MS spectra of all 6 detected peptides. AJI spectra were meaEured in 2-3 seconds after the automatk: collection of the WlS/MS spectra. The inter pretaSon of the observed fragmentation spectra and the identity of the observed peptides 和 indicated in Each panl.doi;10

15、.13 71 /journal.EKine.iXiOOS 5B.gOO2MS光譜的第一步驟被利用在產生一系列直接MSn分析的目標，利用第二個儀器vMALDI-LTQ。一個LTQ質譜儀是一個非常快速, 且有效能的設備，針對 MSn資料的獲得。當遇到使用者已經定義標 準的peak是自動地抽出到一個文字檔案，這個檔案被利用產生儀器控制規準，以便自動地獲得在第二部儀器的片斷光譜。LTQ儀器在每 一個循環重複表列這些peak期望的前驅離子是為了後來的片斷被選 擇和產生離子分析。圖二 B顯示MS/MS光譜的取得是為了 1 fmole 的六個peptide被偵測。每一個串聯的光譜需要超過兩至三秒，而所 有的

16、收集時間大約需要十五秒。產物的光譜表示片斷的變異程度，有 單一電荷peptide的典型片斷路徑。兩個 peptide和它們片斷光譜的 m/z值證實得到氧化的蛋氨酸和色氨酸殘渣 （MS/MS的1363.724 m/z 和2980.595 m。兩個光譜顯示先驅片斷表現從先前的離子比較，有 64 Da的中性損失，提升從 methionine sulfoxide所得之CH3SOH的損 失。這些片斷（已經失去大多數中性基團）的高等級MSn光譜得到關於調整位置的鑑定和確切位置。假如一個能獲得大量的高準確度前驅離子和綜合的片斷資料，複雜peptide混合物的成功分析可能被做到。經由組合兩部配對的儀 器，每一

17、部儀器都能達到最好的特定角色，我們完成那些性質。在組 合中，這些質譜儀提供的資料包含前驅質量測量5-10 ppm準確度，和有益的片斷光譜，當在1 fmole範圍快速運行，且每個 MS/MS光 譜只需要2-3秒。在啤酒酵母菌APC錯合物中蛋白質分的析為了證明我們方法的實用性而分析複雜生物學樣品的特性，我們 分析啤酒酵母菌APC錯合物的蛋白質組成和後轉移調整。圖三顯示8. After bead?- arm wa»hBdl9. prOTOF MA LDI-MS : 319 io haincubalnd with trypsin $olutio>nr Beads are航前aved a

18、nd proteins jiro digvste'd p7. Second IP slp:CelFs are collectedheads are washed. prcigint are eluted with 3xFLAG peptide. Cobslt-Talon Dynal inagn&lic beads are mdded to supernatant10. vMALOMT: 319 MS/MS 11 Xproteo epiriQh engine:Celts are washed 2nd pDllotizad in liquid nitrogen6. First IP stfip： AntiTLAG Dynalmagnetic bezd事areCells