组培考试材料

1、绪论1 组织培养的定义 指无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进培养，使其再生细胞或完整植株的技术与方法，常又称为植物离体培养 2 组织培养的类型 根据外植体来源和培养对象的不同植物组织培养的研究类型可以分为(1) 组织培养;对植物体的各部分组织进行离体培养的方法。包括分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织、愈伤组织等。(2) 器官培养:对植物体各种器官及器官原基进行离体培养的方法。包括根、茎、叶、花、果实、种子等的培养。(3) 胚胎培养:对植物成熟和未成熟胚以及具胚器官进行离体培养的方法。包括幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等的培养。(4)

2、细胞培养: 对单个细胞或较小细胞团进行离体培养的方法。常用的细胞有性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。 (5) 原生质体培养: 对植物的原生质体进行培养的方法。包括原生质体、原生质体融合体和原生质体的遗传转化体的培养等。3 植物组织培养的任务（了解）和研究意义 任务：研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁殖植物的大量快繁方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等。从而改良植物品种，创造新的植物种类，为人类造福。 意义：（1）基础理论研究：试验体系的准确性和

3、可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究（如分化问题）。（2）应用研究：无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化，遗传育种，种质保存，克服远缘杂交，种质资源创新，获得转基因植株。 第一章 实验室和基本操作1 列举几类有代表性的培养基，各有何特点。 植物组织培养使用的培养基，根据物理形状，大致可以分成两类，即固体培养基和液体培养基。在培养基中按培养要求加入一定量的凝固剂（如琼脂、明胶等）即为固体培养基。在培养集中不加入琼脂等凝固剂的即为液体培养基。这两类培养基各有其优点和缺点，我们可以按培养目的的要求不同分别选择采用。 根据培养基的成分和浓度，可以把它们分为含盐量较高的培养基

4、、硝酸钾含量较高的培养基、中等无机盐含量的培养基、低无机盐含量的培养基四个基本类型。 有代表性的培养及种类（1）MS 培养基：无机盐类浓度较高，尤其是铵盐和硝酸盐含量高，能够满足快速增长的组织对营养元素的要求，是一种应用广泛的培养基。但它不适合生长缓慢、对无机盐类浓度要求比较低的植物，尤其是不适合铵盐过高易发毒害的植物。 （2）B5培养基：铵的含量比较低，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素 （3）N6培养基：KNO3和（NH4）2SO4含量较高，但不含元素钼。 （4）White培养基：无机盐浓度较低，在生根培养、胚胎培养中有良好的效果2 培养基的基本组成要素有哪些， 培养基的构成要素通常可分为：水分；无

5、机盐类；有机营养成分；植物生长调节物质；天热物质； pH；凝固剂 培养基的组成大致可分为两个部分，即基本培养基，如MS,Nitsch,N6,B5等和附加成分，如植物激素和天然附加物等。 生长素类物质有利于促进细胞伸长和分裂、促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实、诱导愈伤组织形成。 常用的生长素： IAA(吲哆乙酸 NAA (萘乙酸) 2,4-D(2,4，二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸) 细胞分裂素主要作用是促进细胞分裂和器官分化，促进侧芽分化和生长，抑制顶端优势，延缓组织衰老等，用于离体成花的调控。 常用的细胞分裂素有：KT (激动素) BA(6-卞基腺嘌呤

6、 2-ip(异戊烯氨基嘌呤)ZT（玉米素） 生长素能促进细胞的纵向伸长，它的作用具有两重性：既促进生长，又能抑制生长、甚至杀死植物；既促进发芽，又会抑制发芽；既能防止落花落果，又可疏花疏果。这取决于浓度、细胞的年龄和器官的种类。一般低浓度促进生长，中浓度抑制生长，高浓度则杀死植物。 细胞分裂素能促进细胞分裂和扩大、延迟衰老和保鲜、诱导芽的分化、促进侧芽发育，防止果树生理落果、打破种子的休眠，促使其发芽等作用。 3 配置培养基的步骤 (一）培养基母液的配置配制母液原则：相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；药品要准确称量。1 基本培养基母液注意事项：在配

7、制母液时，应该把Ca2、SO42、Ca2和PO43放在不同的母液中，以免发生沉淀。配制母液的数量可以根据实际情况而定，如MS培养基通常可以配制三液式、四液式、五液式等。一般而论，有机营养成分、大量元素、微量元素可以分别配成一个母液，铁盐和钙盐为单独母液。配制好的母液，在瓶上注明液号、配制倍数、日期。发现母液有霉菌或沉淀变质时，应该重新配制。2 植物生长调节剂母液 在配制植物生长调节剂母液时，有mg/L和mol/L两种浓度单位可供选择。摩尔单位直接代表每升溶液中的分子数量，这使得不同生长调节剂之间具有可比性。此外，在国际性刊物中，摩尔单位时通用单位。植物生长调节剂母液通常用1-10mmol/L，

8、这样的浓度既便于计算也可避免冷藏时形成结晶。由于多数生长调节物质难溶于水，因此配法各不相同。一般2，4-D、IAA、IBA、GA3和ZT可先用少量95%酒精溶解，再用水定容，摇匀后贮于试剂瓶中，贴上标签；NAA可溶于热水或少量95%酒精中，再加水定容至一定体积；KT和6-BA应先溶于少量1mol/L的HCl中，再加水定容。植物生长调节剂母液可以再24冰箱中保存。注意事项：配制的倍数不宜过高，这样可避免一时用不完造成质量的变质浪费，其次也可以避免母液倍数过高，吸量相对过小而影响准确性。 母液配好后，应立即存放于2-4的冰箱中保存备用。母液贮备时间不宜过长，尽量做到有计划配制，预计能在短期内用完。

9、故所有母液应在评上注明配制的日期，以便于检查应定期检查母液，如果出现浑浊或者沉淀以及微生物污染，不宜再用，应重新配制。称取大量元素化合物，只需在感应量为0.01克的扭力天平或者药物天平上称量。称取微量元素、维生素、氨基酸等，则要在感应量为0.0001克的精密光电分析天平上称量。各种化学药品的浓度应适当，过大则会溶解不完全，而且还会引起化学反应产生沉淀，从而影响溶液中药品含量。配制母液时，应用容量瓶定容，使溶液的体积精确的到达刻度线。（2） 培养基的配制 1、取出母液并按顺序放好，并将有机营养物质贮存液溶化待用。将洁净的各种玻璃器皿如量筒、烧杯、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置；2、取一只烧

10、杯，放入1/3左右（配制培养基总量的1/3左右）纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌；3、加入植物生长调节剂和蔗糖，待糖溶解后定容；4、将定容的培养基倒入容器中，加入琼脂，并加热使其完全溶解；5、调整pH,用预先配好的氢氧化钠或稀盐酸进行调整；6、将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口；7、灭菌，用高压锅灭菌（121，1520min）或过滤除菌；8、灭菌后待高压锅温度下降到50以下时，便可以取出、冷却凝固后待用。（三）培养基的消毒（记住认真掌握高压灭菌锅的使用）一般用消毒锅消毒。把装有培养基的三角瓶或试管先放入消毒锅内，但不要装的太满，以保持蒸汽能够在锅内充分循环。装好后将锅盖拧紧，用电炉加热或生火

11、加热，并打开放气阀。待锅内的水沸腾后，放气3-5分钟以排出锅内冷空气，即可关上放气阀继续加热，使锅内蒸汽压力上升到15磅/英寸2，或者1.1公斤/厘米2，温度约120然后维持该压力下15-20分钟即可。此时应特别注意要不断察看气压表，不能使蒸汽压力上升过高，以免使消毒锅超压发生爆炸，或引起培养基中有机营养成分的破坏，而产生不良的影响。但也不能偏低，以免达不到消毒效果。 高温高压消毒时应注意的事项：高压消毒锅，再消毒时均须按规定加至一定量的水。如未加水或加水量不足，均会烧坏消毒锅。但也不宜加水过多，以免浸湿消毒物品。火力应大，升温应快，使消毒时间尽可能缩短。否则时间过长，培养基因受热受压过度，会

12、使其中营养成分遭到一定程度的破坏或者造成不凝固。 消毒完毕放气降压不宜过快，以免培养基压力改变过于迅速，从而从三角瓶中冲出。同时培养基冷却也不宜过快，以免产生许多冷凝水，影响接种。消毒时间从压力表上压力指针上升到所需压力指标是算起，并从指标稳定到所需时间为止。如培养基需作斜面，应在消毒后，凝固前，将试管斜放冷却即可。如果培养基中附加活性炭，应在消毒后，凝固前，将试管或三角瓶用手摇动，或用振荡器摇动，以免活性炭颗粒在培养基中不均匀或下沉。4 简述培养基配置后培养条件如何控制 配制好的培养基一般要在室温、黑暗且清洁的地方放置35天再使用。如需较长时间保存，必须保存在黑暗、低温（1520）、低湿并且

13、清洁的地方，但配制好的培养基不宜保存过久，一般不超过1个月。保存时间太久，培养基可能会污染、脱水、易分解的成分会发生分解，培养基成分会发生较大的变化。 培养条件是调控外植体生长和分化的外界条件。植物组织培养中，大的环境条件如温度、光照、湿度等是被严格控制的，而培养基成分和pH等的变化时通过培养基的更新来实现的。 （1）温度：培养室的温度，一般设定在（25+或2)。但是不同植物对环境温度的要求各异，条件允许可以根据其具体要求设定培养室温度。一般培养室的温度，最高不高于35，最低不低于15 （2）光照：根据不同植物的需求，控制好光强度、光质和光周期。一般情况下，培养室的光周期设定为16h光照、8h

14、黑暗（ （3）湿度：植物组织培养是的相对湿度，常年保持在30%为宜。（4） 营养物质和pH值：由于营养物质会逐渐减少，pH会因为大量金属离子被吸收而降低，因此，最好每月更新一次培养基，也可以增加培养及数量，选用营养元素能被平衡吸收的培养基。（5） 气体 注意氧气供应，使培养基瓶内与外界保持通气状态，培养物产生的二氧化碳浓度过高会阻碍培养物的生长分化。注意：培养基的pH一般被调节到5.06.0 之间，最常用的pH为5.75.8。pH过高时，培养基会变硬；pH过低时，则影响培养基的凝固。在调整pH时，常用NaOH或HCl来进行（浓度为1mol/L或0.1mol/L）。第二章 植物组织培养

15、的原理1 细胞全能性、分化、脱分化、再分化概念 细胞全能性：每一个植物细胞带有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。 分化：分化是指植物体各个部分出现异质性的现象，可以在细胞水平、组织水平或器官水平上表现出来，如细胞分化、组织分化、花芽和叶芽以及茎、根等器官分化。 细胞分化：细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。 脱分化：也称去分化，是指离体培养条件下生长的细胞、组织或

16、器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而回复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。 再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官、甚至形成完整植株的过程。2 离体培养植株再生途径有（器官、胚胎，老师说考填空） 离体培养中再生植株的主要途径是器官发生和胚胎发生。3 影响细胞再分化和脱分化的因素有 （1）损伤。外植体由于切割损伤的刺激，导致细胞内一系列生理生化的变化，促进细胞增殖，这可能使生命的一种自我调节机制。（2） 生长调节剂。主要是生长素类起作用，因而在诱导愈伤组织时常加入生长素类，但同时

17、配合使用细胞分裂素则效果可能更好。 （3）光照。弱光或黑暗条件下常有利于脱分化中的细胞分 裂。 （4）细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的 刺激有不同的敏感性。 （5）外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。 （6）植物种类差异。不同种类的材料脱分化难易有所区别，双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。4 两种愈伤组织的类型 愈伤组织的质地明显不同，松脆和致密两种类型，但它们之间是可以相互转变的。一般加入较高浓度生长素，可使致密的愈伤组织变得松脆；而降低或去除生长素或加入高浓度细胞分裂素，往往使愈伤组织变得致密。5 体细胞胚胎发生的概念 合子胚：在正常情况下，植物

18、胚胎发生是指受精后的一系列连续过程，即从合子（受精卵）到成熟胚的发生、发育的有规律变化，这种情况下形成的胚成为合子胚。 胚状体：在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经了一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体。 体细胞胚胎发生：成熟的胚状体可以象合子胚一样长出根、芽、萌发再生植株。植物离体培养细胞产生胚状体的过程称为体细胞胚胎发生。6 组织培养存在的三大问题是 （1）污染 是指在组培过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器中滋生大量菌斑，是培养材料不能正常生长发育的现象。 原因：培养基及各种接种器皿灭菌不彻底；外植体灭菌不彻底

19、；操作时人为带入污染；环境不清洁；超净工作区域不清洁。 解决措施：灭菌要彻底，操作要正确，接种器具随时注意消毒，接种人员接种时应该用75%酒精擦拭双手合培养基表面；保持操作区环境清洁；污染的外植体要及时淘汰。 （2）褐化现象含义：指对于富含多酚化合物的植物，在接种时由于切割或剥离使组织收到伤害，该类物质会在多分氧化酶的作用下氧化褐变，是培养基变黑，并严重抑制外植体生长和分化，严重时导致培养物死亡。 解决办法：在培养基中加入抗氧化剂（抗坏血酸，柠檬酸，半脱氨酸，二硫苏糖醇，乙烯吡咯烷酮PVP）；不断转移培养基，减少积累；加入1的活性碳；在弱光或黑暗下培养，光能促进多酚化合物的氧化 （3） 玻璃化

20、现象：指组织培养中，呈现半透明状的畸形试管植物，这类植物被称为“玻璃化苗”。在离体培养中，再生植株长成玻璃苗的现象，被称做玻璃化作用。 原因：细胞生长过程中的环境变化，试管苗为了适应环境变化而玻璃化、 玻璃化的生理生化特点：叶绿素含量比正常植株低110倍；蛋白质比正常植株低0.34.5倍；木质素含量比正常低；一些酶的活性远远低于正常苗，如黄烷酮合成酶、羟基肉桂C0A：NADP还原酶、羟基肉桂醇脱氢酶、苯丙酸解氨酶等；内源根皮苷比正常苗低。 解决办法： 提高琼脂的浓度；改善容器的通气状况；调节培养基组分：减低NH4可以减少玻璃苗，或加入根皮苷和Ca 2的浓度，都可减少玻璃苗。7 器官发生途径 直

21、接器官发生（器官型）：直接从外植体的细胞形成器官原基，然后发育成器官。 间接器官发生（器官发生型）：先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基，后形成不同器官。第三章 植物器官和组织培养1 植物器官和组织培养的基本程序 （1）无菌外植体的获得 作为良种的材料，必须准确选取优良的母株、种源可靠、性状稳定 、生长健壮、成年的母株；切忌用实生苗繁殖良种，其种性不能保持，童期长。从自然界和室内采集的植物器官和组织材料携带有各种微生物，这些污染源一旦进入培养容器中，造成培养基和培养材料污染，实验无法进行。所以要进行消毒处理。外植体消毒一般过程 流水冲洗1020min或更长时间，70%75%酒精中浸泡

22、30s，用0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右或者在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右，最后用蒸馏水冲洗45次，备用。 （2）初代培养物的建立 外植体经过灭菌处理后，要建立起初代无菌培养材料，并使其增殖和发育，还需以下3个技术的配合：A、无菌环境就是保证材料无菌（含内生菌的可在培养基中加抗生素），培养基、接种器械和超净工作台无菌，并保证接种室、培养室环境的清洁。B、规范操作不要因人为的因素带入真菌等，可用75的酒精消毒超净工作台和操作人员的双手。C、合适的条件培养基的组成、外植体类型等。 （3）形态发生和植株再生 (4)培养产物的观察和记录 2 愈伤组织形成是脱分化的结果，

23、细胞分化的结果是形成不同的组织 第四章 植物胚胎培养和离体授粉1 胚胎培养的概念 植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。 2 根据剥取的离体胚发育时期的不同可以分为（幼胚培养）和（成熟胚培养），各有何特点 成熟胚为子叶期以后的胚，其在简单的培养基上即可萌发生长。对营养条件要求不严格。主要用来繁殖不易萌发植物，或研究胚和胚乳及子叶的关系等。 幼胚培养-是指处于原胚期、球形期、心形期、鱼雷期的胚培养；幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功3 胚胎培养的应用 1、克服远缘杂交不亲和性 2、打破种子休眠，缩短育种周期 3、提高种子

24、萌发率 4、快速繁殖良种砧木 5、诱导胚性愈伤组织4 离体授粉|试管受精的概念 是指将未授粉的胚珠或子房从母猪上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。5 离体授粉的类型 1. 离体柱头授粉 2. 离体子房授粉（1）活体子房内授粉（2）离体子房内授粉 3. 离体胚珠授粉6 离体授粉的意义 可以克服缘杂交中的不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。克服自我不亲和性诱导孤雌生殖双受精及胚胎早期发育的机理研究 第5章 植物花药和花粉培养 花药培养和花粉培养是指在人工合成培养基上，改变花粉的发育途径, 使其不形成配子，而像

25、体细胞一样进行分裂分化，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。1 获得单倍体植株的两个途径是花药培养（也称器官培养）和花粉培养（也称细胞培养）2 花药培养和花粉培养的具体流程（花粉培养注意要预处理） 两者的异同点； 相同点：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。不同点：花药培养属器官培养，花粉培养属细胞培养； （一）花药培养 花药培养包括：选择材料-消毒-接种培养-愈合组织生成-分化出单倍体植株 花药培养一般选择花粉的单核期进行接种（1） 外植体的选择 外植体的遗传背景、生理状态和花粉发育时期。选择花粉发育适宜时期（一般是单核中晚期到双核早期）的花蕾。

26、镜检花粉发育时期，并根据发育时期与花蕾大小、外观形态和颜色等的相关性，选择适宜的花蕾。（2）材料预处理低温处理一般在3-5处理3-10d，高温处理一般在35处理1-3d。（3）材料消毒（4）接种 尽可能地避免花药受到损伤；接种速度尽量快；注意接种密度。（5）培养：一般先在25有光或黑暗条件下进行脱分化培养。 23周后，花药中的小孢子经大量分裂形成胚或愈伤组织。转入分化培养基上培养，45周后，小植株形成。 （6）植株再生 （7）单倍体确定及染色体加倍 单倍体确定方法，可以镜检根尖染色体数，或根据气孔周围保卫细胞的大小来确定。 染色体加倍，用秋水仙素处理。 培养阶段：培养基中加入50-250mg/

27、L秋水仙素。 移栽后：用0.2%秋水仙素浸泡生长点1-3d，或每日傍晚点滴生长点数滴，进行5-6d （二)花粉培养：花粉培养包括花粉的分离-预处理-培养过程。 1、花粉的分离与纯化 （1）自然散落（2）挤压法 （3）机械游离 2、花粉培养 3 选择时期 花粉培养选择花粉发育适宜时期（一般是单核中晚期到双核早期）的花蕾4 花粉培养的方式有、1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。 培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织

28、释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。5 掌握看护培养和条件培养的概念 6 怎样获得单倍体和三倍体（胚乳培养） （1）获得单倍体的途径 获得单倍体植株的天然途径有：孤雌生殖和无配子生殖 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。花药培养、花粉培养；胚珠或子房培养（未受精）。（2） 三倍体 胚乳培养 二倍体在减数分裂中期用秋水仙素处理

29、，使之发育为四倍体，之后成熟四倍体与二倍体杂交可得三倍体 第六章 植物细胞培养1 植物细胞培养的概念 是指对植物器官或者愈伤组织上分离出的单细胞或者小细胞团进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术2 悬浮培养的分类 成批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法 连续培养：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。3 影响细胞培养的因素，书本114页 （1）培养基 4 人工种子的概念 是指植物离体培养中产生的胚状体或者不定芽，被包裹在含有养分和保护功能人工胚乳和人工

30、种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒。第七章 植物原生质体培养及细胞融合1 原生质体分离的方法 （1）机械分离法：将细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞产生质壁分离，原生质体收缩成球形，切开细胞壁使原生质释放出来（2）酶分离法：2 原生质体纯化的方法 （1）飘浮法 原生质体的相对密度较小，在较高浓度的溶 液中离心后会漂浮在液面上。（2）沉淀法 低速离心使原生质体沉于底部。微孔滤膜过滤，除去未消化的组织细胞等，低速离心（150g以下)，3-5 min，弃上清和酶液，后用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤原生质体，2-3次。（3）不连续梯度离心法 不同相对密度的原生质体漂浮在不同的浓度梯度的界面上。3 影响

31、原生质体数量和活力的因素（书本132页有另外一种答案，大家也可以参考一下）【书本答案】（1）供试材料： （2）酶液及酶解时间 （3）渗透压稳定剂 （4）质膜稳定剂 （5）pH 【ppt答案】分离材料的生理状态（旺盛分裂时期的材料） 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、 酶溶液的渗透压、质膜稳定剂、酶液pH 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离 持续时间环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 4 原生质体培养的方法 （1）液体浅层培养 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。优点： 操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物，细胞植板率高缺

32、点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。（2）液体固体双层培养 在培养皿的底部铺一层琼脂固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。优点： 原生质体分布均匀，容易获得单细胞株系，固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：原生质体易受热损伤，易破碎。（3）固体平板培养 即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培

33、养皿底部，封口后进行培养。优点： 可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。缺点： 操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。（4） 琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。5 原生质体融合的概念 通过物理或者化学

34、的方法使原生质体融合，经培养获得具有双亲全部或者部分遗传物质后代的方法。6 原生质体融合的方法 化学融合 以化学试剂作为融合诱导剂，诱导原生质体融合，主要有PEG融合法和高钙-高pH法等。物理融合 用电激、离心、振动等机械方法来促使原生质体融合，主要有电融合法和超声波法。第八章 植物离体快速繁殖1 快速繁殖的概念 植物离体快速繁殖（propagation in vitro）又称植物快繁或微繁，是指植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。2 离体快繁程序 (1)无菌（或初代）培养的建立:这个阶段的任务是母株和外植体的选取、无菌培养物的获得及外植体的启动

35、生长，以利于离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生类型进行增殖。 (2)繁殖体增殖:选取适当的增值培养基，增殖体一般携带一个茎节，但第一次增殖的茎段一般都有24个茎节 (3)芽苗生根:将单个芽苗转移到生根培养基或适宜环境中诱导生根 (4)小植株的移栽驯化：试管小植株的移栽驯化是试管苗从异养到自养的转变，有一个逐渐适应过程。移栽前需对试管植株进行高光强炼苗，使植株生长粗壮，并打开瓶口，降低湿度，使其逐渐适应外界环境。 3 植物器官再生分为五种类型，哪五种， 短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型和原球茎发生型。 4 影响植物快繁的因素 （1）外植体； 外植体的来源：最适的为茎尖、带

36、芽茎段，也可以利用叶片、子叶、根段、花器官组织等。 外植体生理年龄：幼嫩组织分化能力更强。 外植体大小：不能太小，否则影响成活率。除非是用于脱毒苗的生产。 （2）培养基 基本培养基：MS培养基应用最为广泛。对于某些植物及生根阶段，以1/4或1/2MS较好。蔗糖和葡萄糖浓度为2-4%。生根时稍低。 植物生长调节剂：主要以细胞分裂素和生长素的配合使用，调节外植体的生长和分化。另外ABA、GA、CCC等也具有不同的作用。 培养基的物理特性：以固体培养较为普遍，也有采用液体培养，如兰花原球茎的增殖。 （3）培养条件 光照：1000-3000 lx，阶段可增强。14-16h/d。 温度：与植物的原产地相

37、应。一般为25±2。有时可进行高温或低温的预处理。 湿度：要求环境相对湿度不能太低。 气体：要求培养基及培养瓶通气良好，同时及时转接。液体培养要求振荡培养，促进氧气交换。 （4）继代培养 主要指对阶段增殖形成的芽丛、胚状体或原球茎等进行转接继代。继代间隔时间一般为20天左右。 （5）移栽 根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强。 叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽要求打开瓶口驯化2-3天；或在瓶内添加一些生长延缓剂如PP333、CCC等培育壮苗。5 植物快繁商业化生产应注意的问题，如何防止 （1）污染-是指在组培过程中，由于真菌、

38、细菌等微生物的侵染，在培养容器中滋生大量菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。发生原因：培养基及各种接种器皿灭菌不彻底；外植体灭菌不彻底；操作时人为带入；环境不清洁；超净工作区域不清洁。 解决措施：灭菌彻底：灭菌锅压力1.0551.406 kgcm2、温度为121126，应保持灭菌时间2030min；操作正确：接种器具每次使用后应用酒精灼烧；操作人员接种时应用75的酒精擦拭双手和培养瓶表面，操作区内不要放入过多待用培养瓶以防止气流被挡住保持操作区环境清洁：接种室环境、超净工作台、培养室环境及时淘汰污染的外植体材料，若材料有限，可进行二次灭菌 （2） 遗传稳定性影响遗传稳定性的因素基因型。培

39、养材料的基因型不同，发生变异的频率也不相同。继代次数。试管苗继代培养次数和时间是造成遗传变异的关键因素，一般随继代次数和时间的增加，变异频率呈上升趋势。器官发生方式。离体器官5种发生方式中，以茎段、茎尖等形成的丛生芽、单芽、不定芽的方式繁殖，不易发生变异或变异率极低。降低遗传变异的措施：选用不易发生遗传变异的基因型材料； 缩短继代时间，限制继代次数，继代一定时间后，重新开始外植体的继代培养； 采用不易发生遗传变异的增殖途径； 采用适当的生长调节物质和较低的浓度，减少或不使用易引起诱变的物质，及时剔除生理和形态异常苗。（3） 玻璃化 是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，表现为叶和嫩

40、梢呈水浸透明或半透明水渍状。原因分析：玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。1. 激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高(或细胞分裂素与生长素比例高)，易导致玻璃化苗的产生。2. 琼脂和蔗糖浓度 培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少。3. .温度 适宜的温度可以使试管苗生长良好。温度与玻璃化程度呈正相关。4.光照时间 大多数植物在1012h/d、光照强度15002000lx 下都能生长良好。高温加上光照不足加速玻璃化。5通风条件 试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于

41、生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。6. 离子水平 如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。NH4+ 含量高易引发。解决办法：提高琼脂、蔗糖的浓度；改善容器的通气状况；增加光强调解培养基组分：减低NH4可以减少玻璃苗，或加入根皮苷和Ca2的浓度，都可减少玻璃苗。（4） 褐化 褐化是指外植体或培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。 影响褐化的因素：植物种类和品种；2.外植体的生理状态；培养基的成分；培养条件 解决办法： 1.取材季节：冬春季节；2.选择合适的外植体：分生能力强；3.在培养基中加入抗氧化剂（抗坏血酸，柠檬酸，半脱氨酸

42、，二硫苏糖醇，PVP）； 4.吸附剂：活性炭 5.加快继代转瓶速度 （5） 黄化：黄化是指试管苗幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳的现象。 黄化发生的影响因素 培养基成分。培养基中铁元素含量不足，矿物质营养不均衡，激素配比不当，糖用量不足或已耗尽。培养条件。培养瓶通气不良，乙烯含量升高，温度不适，光照不足。pH。pH变化过大。抗生素类。培养基中添加一些抗生素类物质，如青霉素、链霉素、头孢霉素等。控制措施 检查培养基配制过程，保证培养基成分正确添加；调节培养基组成和pH；控制培养室温度，增加光照，使用透气瓶塞改善瓶内通气情况；减少或不用抗生素物质。第9章 无病毒苗木培育1 脱毒的方法 目前常

43、用脱毒方法有生物学方法、物理方法、化学方法等。 茎尖培养与热处理结合，是最常用而有效的脱毒途径。2 影响茎间脱毒的因素、 培养基 合适的培养基有利于由茎尖培养获得完整植株。较大的茎尖外植体（大于500m）在不含生长调节物质的培养基中也能产生完整植株，但加入少量（0.10. 5mgL）生长素或细胞分裂素或二者兼有常常是有利的。 外植体 在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖外植体的存活率，但脱毒效果与外植体的大小则呈负相关 。叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。 培养条件 培养条件在茎尖组织培养中，光照培养的效果常比

44、暗培养好。某些植物茎尖培养的不同阶段对光的需求不同，有的需要一定时期的完全暗培养。 茎尖培养的温度一般为25±2外植体的生理状态 茎尖最好取自生长活跃的芽上。取芽的时间很重要。在温带树种中，植株的生长只限于短暂的春季，此后很长时间茎尖处于休眠状态，直到低温或光打破休眠为止。在这种情况下，茎尖培养应在春季进行，若要在休眠期进行，则必须采取适当处理。茎尖培养的效率取决于外植体的存活率、茎的发育程度、茎的生根能力及脱毒程度。3 脱毒的机理 病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分布。在受侵染的植株中，顶端分生组织无毒或含毒量极低。较老组织的含毒量随着与茎尖距离的加大而增加。分生组织

45、含毒量低的原因可能是 在植物体内，病毒可通过维管束组织系统长距离转移而分生组织中不存在维管束。病毒也可通过胞间连丝在细胞间移动，但速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖。在旺盛分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制。在植物体内可能存在病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒的增殖 植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在着竞争。在旺盛分裂的细胞中植物核蛋白合成占优势，在细胞伸长期间病毒核蛋白合成占优势，因此加速分生组织细胞的分裂能够获得无病毒植株。 病毒的遗传物质是核酸，当其进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制，热处理并不能杀死病毒，只

46、能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内的增殖减缓或停止，失去侵染能力。热处理也可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。4 病毒检测的方法（填空） （一）直接测定法（二）指示植物法（三）血清鉴定方法（四）核酸分祈法（五）电镜鉴定法第10章 植物体细胞无性系变异1植物体细胞无性系变异的概念 指培养物在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象。2植物体细胞无性系变异的影响因素 （1）外植体 外植体的类型、生理状态等因素明显影响体细胞无性系变异的频率。一般而言，培养特异化程度高或衰老的组织，产生变异的几率大；而培养分生组织或幼龄的外植体（如顶芽、腋芽、分生组织），则发生变

47、异较少。 （2）物种和基因型 体细胞无性系变异具有对物种和基因型的依赖性，即无论再生模式如何，物种和基因型都影响着体细胞无性系变异的发生。 另外，源植株的倍性也是一个重要因素，多倍体和染色体数目较多的植物其变异频率比二倍体和单倍体高。 （3）培养基基本培养基的某些成分会使培养物倍性改变。生长调节剂可能是起一种诱变剂的作用。植物生长调节剂的异常浓度引起体细胞无性系变异。不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂（4） 继代培养时间第十一章植物种植资源的离体保存种质资源的离体保存（germplasm conservation in vitro ）是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原

48、生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。1 植物限制离体保存方法低压保存法 低温保存（low temperature connation）是限制生长应用最广方法：一般是在19。 （一些热带、亚热带植物在1020）下培养，并经常同时提高培养基的渗透压。在这种条件下，培养物的生长受到限制，继代培养时间间隔数个月至1年以上。这对中、短期种质的贮存是非常合适的。一旦要利用这些种质，只要把培养物转移到常温（正常）下培养，即可迅速恢复生长。高渗透压保存法 通过提高培养基的渗透压，达到抑制培养物生长速度的保存方法。这种方法主要是通过影响离体培养物的

49、吸收作用而减缓培养物的生长。. 提高蔗糖浓度到10%左右 . 外加甘露醇、山梨醇等惰性物质 一般可用2%3%蔗糖加2 % 5 %的甘露醇生长抑制剂保存法 在离体种质资源保存中，采取一定措施来延缓或抑制离体培养物的生长发育，达到保存种质的目的。 通常采用外源生长抑制剂（或延缓剂）来延缓培养物的生长。 最常用的是天然生长抑制剂ABA，具有抗赤霉素的作用，阻碍RNA聚合酶的活性， 抑制DNA合成，从而达到抑制外植体生长的目的。其他限制生长保存法降低氧分压保存法 通过培养容器内降低氧分压，改变培养环境的气体状况，能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离体保存种质的目的，其原理类似于果蔬类的

50、贮藏保鲜方法。如果培养容器内的氧分压太低，则会产生毒害作用。干燥保存法 降低培养物水分，其生命活动就能延缓，这与传统的种子干燥贮存类似。 如对胡萝卜体细胞胚、愈伤组织进行脱水处理（将离体材料放在滤纸上，置于空气流动无菌箱中风干4 7 d ），然后置于加生长延缓剂或限制蔗糖的条件下保存。在不含蔗糖而其他条件正常的培养基上可以保存7年。保存过程中脱水和限制糖的供给量常被看做是一个正常种子成熟经历的类似过程。2 超低温组织培养的保存概念植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196 液氮）条件下进行保存的方

51、法。 3 超低温保存应该采取的措施必要的措施： 选择细胞内自由水少，抗冻能力强的植物材料 采取一些预处理措施，提高植物材料的抗冻能力 在冷冻过程中尽量减少冰晶的形成，避免组织细胞过度脱水 在解冻过程中避免冰晶的重新形成以及温度冲击导致的渗透冲击（osmotic stress）等4 超低温保存的基本程序（）植物材料（培养物）选取 选择遗传稳定性好、容易再生和抗冻性强的离体培养物作为保存材料是超低温保存离体种质成功的关键。 主要有三类： 愈伤组织、悬浮细胞、原生质体； 花粉和花粉胚； 茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株。各论（二）材料预处理 预处理的目的是使材料适应将遇到的低温条件， 提高新分裂细胞的比

52、例。 常采用的办法是对超低温保存的离体培养物进行低温预处理和加入冷冻防护剂。 常用的冷冻防护剂有甘油、二甲亚砜（DMSO）、脯氨酸、糖类、聚乙二醇、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。对植物来说，DMSO 是最好的防护剂，用于培养细胞适宜浓度5%- 8%。（三）冷冻处理 常采用四种冷冻方法，即慢冻法（Slow cooling method ）、快冻法（fast cooling method ）、预冻法（prefreezing method）和干冻法（dryfreezing method）。（四）冷冻贮存 由于液氮在不断挥发，所以，必须定时补充液氮以保证植物材料的持续保存。如果冷冻在196 下的材料要长

53、期贮存，则需一个液氮冰箱。（五）解冻 解冻是将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一步恢复培养。解冻的速度是解冻技术的关键，解冻可分为快速解冻（fast thawing）和慢速解冻（slow thawing）两种方法。（六）再培养 解冻后，有的材料需用培养基洗几遍后（去防护剂）再接种到新鲜培养基上进行再培养，有的材料洗涤后反而培养不活，应直接接种于新鲜培养基上。 有一部分材料在冷冻保存时被冻死，使得再培养的成活率达不到100 %，因而需要测定培养物活力，以剔除没有生活力的培养物。 测定方法有FDA染色法、TTC还原法、Evans Blue染色法等。试管花卉是将组织培养的无菌苗接种于形态各异、

54、装有各色基质并具观赏价值的瓶子里, 以达到可以直接用于观赏的目的。 特点是植物生长在一个相对封闭的环境里, 可制作成为各种挂饰、摆设,方便携带运输, 易于出口, 不需要特别的养护等。根据是否可以开花可分为两大类赏花类和赏叶类。.根据外装饰的大小，又可分为摆饰和挂饰两类， 挂饰以迷你型为主，摆饰类则相对较大。以“微”见奇，以“新”取胜，是一种生命的装饰1 草莓茎间脱毒的方法主要病毒： .草莓斑驳病毒(SMoV) 草莓皱缩病毒（SCrV） .草莓镶嵌病毒（SVBV） .草莓轻型黄边病毒（SMYEV）脱毒技术. 茎尖培养法 . 茎尖培养和热处理相结合 . 花药培养法草莓脱毒苗的培育 1、茎尖培养法诱导：MS+BA0.5+GA3 0.1+IBA0.2 分化：MS+BA0.51.0 （20 d分化丛生芽） 生根：1/2MS+IBA0.21.0（根长2-3 cm） 炼苗、移栽1.茎尖培养脱毒 剪取5 cm左右的顶梢，剪去叶片 自然水冲洗 70%酒精浸3-5 s 0.1升汞210 min，无菌水冲洗 剥离茎尖外面的幼叶和鳞片，切取带有1-2个叶原基的生长点接种2.热处理和茎尖培养相结合脱毒（1）40处理16 h，35处理8 h；