肌纤维多样性调控机制

1、外文翻译肌纤维多样性调控机制摘要:成体骨骼肌由大量成束的肌纤维细胞组成。通过比较不同肌纤维的生理特性和收缩蛋白亚型表达方法可以断定在哺乳动物至少存在有三种不同类型的肌纤维。不同的骨骼肌，肌纤维组成也有广泛差异。最近的研究表明，在肌纤维发育过程中，多种机制可影响肌纤维类型的产生。肌前体细胞可依据肌球蛋白重链(MHC)分化表达的亚型分为两种。神经和环境影响决定肌纤维表达的收缩蛋白类型，这一点对MHC最为明显。其他收缩蛋白基因组最初则受MHC基因组的单独控制，其后则有一个或多个因素协调亚型基因组表达来影响发育过程，产生成体表型。肌肉基因表达研究显示，调控作用可发生在转录，转录产物选择性剪切，mRNA

2、稳定，以及翻译过程中。目前的主要研究是阐明环境因素和功能信息是如何影响肌肉基因表达调控活动的。关键词：骨骼肌；肌肉胚胎学；成肌细胞1骨骼肌多样性成熟骨骼肌的产生日益被证明是用来研究控制组织分化和成熟机制的一项引人瞩目的系统。骨骼肌作为模型系统其优势在于，体内和体外实验结果一致并且不同发育和成熟阶段特异性的分子标记范围较宽。关于骨骼肌发育另一个至关重要的问题就是肌纤维多样性的产生机制。成熟的骨骼肌是成束的肌纤维组成的。每条肌纤维是一个多核细胞,通过肌腱滑行为骨骼肌提供独特的收缩活动。在一块肌肉中至少可以生理和生化性的鉴别到三种甚至更多类型的肌纤维1。其中一种类型基于收缩速率慢而得来，主要用于氧化

3、呼吸。至少有两种类型的快收缩的肌纤维,其中一个用于糖酵解(F2B),另一个用于氧化-糖酵解 (F2A)。此外, 食肉动物的颚肌包含超高速肌纤维2,也有报道在哺乳动物存在第三种类型的快速收缩的肌纤维3。不同肌肉内不同纤维类型组成因空间组织结构以及对他们对肌肉活动贡献大小各异，并且即使是特定肌肉也会因不同物种而存在差异1)。因此,骨骼肌的发育引出以下问题：发育过程中是肌肉纤维多样性如何调控的以及进化过程中这些特定的肌肉多样性又是如何选择性改变的。为了解释这些问题，有必要获得用来决定发展进程的代表性分子标记。初步假设,如果我们能定义了发育关键步骤中特定的调节基因，就能够理解控制这一过程的的决策机制。

4、虽然这样的一个方法潜在要求就是无可避免的去寻求控制阀, 但是在过去的5年已经取得了相当大的进步，特别在分子水平上的定义了这一问题并且在细胞生物学水平上给出了识别特异肌纤维的方法。2肌纤维多样性的分子基础具有收缩性结构的组成部分是肌纤维类型最典型的代表性标记。利用不同基因产物产生收缩结构，从而反映了不同骨骼肌收缩特性的差异性4。8种定位良好的多基因族对肌小节（收缩单位）主要组成部分有重要作用。他们分别是肌球蛋白重链（MHC）,碱性肌球蛋白轻链（MLC）,调节MLC，肌动蛋白，原肌球蛋白（TM），肌钙蛋白亚基（TnC），抑制亚基（TnI）以及原肌球蛋白结合亚基（TnT）。除肌动蛋白外其他类型都专一

5、为快收缩和慢收缩肌纤维编码蛋白质（见表1）。此外， MHC多基因家族编码至少三种，大概五种与不同类型成肌纤维相关的快收缩纤维亚型5(见表1)。表1.不同成体骨骼肌收缩蛋白亚型a基因家族骨骼肌慢快MHC MHCSF2A，F2B，F2X，FEO，FSFAlk MLC1Sa，1Sb1F，3FReg MLC2S，2S,2FActinskskTropomyosin，S， FTroponin CSFTroponin ISFTroponin TSFa快缩型MHC基因的5种亚型，只有F2A，F2B和FEO在分子基础上定义了，F2A，F2B因在快肌纤维内表达而得名。FEO在成体肌膜外发现。F2X在抗体分析和蛋白

6、分析基础上命名。FSF在鄂肌表达超速收缩性能和抗体分析和蛋白分析基础上命名在所有的收缩蛋白中，大多数研究集中在MHC。 这在某种程度上反映了肌纤维收缩速率和MHC组成ATP酶活性的密切相关性6。表明MHC亚型表达和肌纤维生理存在直接的因果关系。针对MHC亚型特异性的抗体和DNA探针被利用来追踪肌纤维决定步骤。已经证明,成体慢型MHC的在早期胚胎中检测到，而快收缩MHC在胚胎期通常没有7。然而已经发现，两种MHC亚型（emb和neo）领先成体快收缩亚型表达7。因此,从一个胚胎学的观点来看，仅存在三种MHC标记存在(或者与成体亚型表达相关)：slow，emb以及neo. 近年来，系统性的cDNA克

7、隆和编码所有具有收缩性的结构基因基本完成8。除收缩性结构外，肌浆网中Ca2-ATP酶也被产生快慢亚型的对基因族所编码9。由于标记的可信性，使各种各样的快收缩和慢收缩纤维标记活性化来表述肌肉发育成为可能。3肌肉组织胚胎学骨骼肌纤维是由暂时独立的的成肌细胞融合物构成的多核肌管构成成熟后成为肌纤维1。在鸟类和齧齿类动物的四肢，第一层成肌细胞融合物形成初级的肌管，肌管开始形成于肌群分裂为独立的肌肉之前10。次级肌管形成开始于初级肌管形成后，这些次级肌管紧密相接且与初级肌管相对10,11。在人类还存在第三级成肌细胞融合物，形成三联管12。重要部分工作是致力于建立初级肌管和次级肌管与他们的最终命运的关系

8、10,11。图1简易图解了发育中的小鼠肢体初级和次级肌纤维MHC亚型表达的命运。就初级肌管而论第一MHC基因表达编译MHCemb,而在成熟时并不表达。随后另两种MHCneo和 MHCslow亚型在除去比目鱼肌外所有初级肌管进行表达（表1）。除比目鱼肌外，第一关键步骤与互相排斥的MHCneo或 MHCslow继续表达有关，这也与最终形成快或慢收缩性肌纤维步骤相对应，然后快系肌纤维表达决定成体MHC类型。与之相反，在MHCslow表达决定之前，次级肌小管先促进MHC emb+neo的表达。这标志着此决定与肌纤维命运的相关性，随后这些对MHC emb+neo限制性表达的纤维决定成体快缩MHC亚型（表

9、1）。以往我们认为 MHC emb和neo是快系胚胎期的亚型7。这可能反映了MHC emb，neo以及adult fast基因染色体连锁,而MHCslow位于一个独立的染色体上5。这二者之间的联系之所以引起相当大的关注，是因为它独特的MHC基因家庭和这种基因结构所可能反映的基因顺序表达13。初级肌小管 次级肌小管 emb embemb emb emb slow neo neo emb emb emb slow neo neo slow slow slow F2A F2B F2X slow F2A F2B F2X图表1.哺乳动物四肢发育阶段MHC亚型表达肌小管命运简易图解体内初级和次级肌小管早期

10、表型不可预测其在成体的纤维表型（表1）。因此很明显，涉及MHCneoorslow表达的决定可能是决定纤维的命运关键的一步。目前，很少有数据关注MHC表达的快肌纤维后期分布。和可能，此步骤可能会耦合感应到纤维表达MHC的F2B 亚型所需能量代谢中的糖酵解作用。LaFrambiose等（3）人发现老鼠隔膜遵循这一过程。他们发现表达MHC2A或 2B的大多数成肌纤维曾表达过MHC2x。此外，许多纤维会短暂表达MHC2B。这些数据表明特定肌纤维中成体MHC 快型最终表达选择比表1阐明的要复杂得多。我们尝试着解释肌纤维多样性集中决定MHCfast或slow 的机制，至少有部分原因是由于适宜试剂的可用性，

11、部分由于肌肉功能中MHC分子的重要作用。基本上根据快与慢肌纤维决定，提出了这两种截然不同的观点。4成肌细胞预决定20世纪70年代中期，Hauschka以及他的同事首次证明成肌细胞是不相同的。在不同的细胞培养条件下，证实了雏鸡胚胎期和胎儿期成肌细胞可根据培养基类型划分为不同类型14。培养基可根据培养中形成的肌小管形态分为两种14。最新研究将肌纤维分为成纤维细胞生长因子依赖性和非依赖性两种15。通过辨别不同成肌细胞类型不可避免的让我们想到不同成肌细胞预决定各自将要形成的肌纤维类型。肌纤维多样性预决定的基本模型：1）由单一成肌细胞培养繁殖分裂而来的每一个肌小管起初是同一纤维类型，2）体外观察到的不同

12、成肌细胞与体内相关的纤维类型是一致的，3)成肌细胞表型可完全预测最终成体肌纤维类型。这一模型应用MHC抗体经体内外在鸟类和哺乳动物成肌细胞和肌小管得到检测。Miller 和 Stockdale证实雏鸡胚胎期成肌细胞可根据不同类型的MHC表达分化形成的肌小管类型分成两类：一类仅表达MHCfast，另一种表达MHCfast和MHCslow（SM1和SM2亚型）。与此对比，胎儿期成肌细胞初期表达MHCfast，随时间延后也表达SM1。MHCfast抗体检测到的基因产物数量未知，导致无法与哺乳动物进行对比。但是，雏鸡如此多的成肌细胞类型反应了后肢内各自肌小管类型的多样性并且这些成肌细胞稳定遗传17。因

13、此在当时已经可以证明与体内观察到得MHC表型与在四肢成肌细胞类型的存在的一一对应关系，但是却未能建立这些成肌细胞类型与及成体纤维类型之间的关系。在发育中的啮齿动物上开展类似研究获得了较简单的结论。Cossu及其同事18观察到胚胎期小鼠成肌细胞培养（初级肌小管形成）可表达MHCemb和slow，胎儿期小鼠成肌细胞（次级肌小管形成）只表达MHCemb18，而且胚胎期小鼠成肌细胞形成小的肌小管，胎儿期形成肌小管较大。由于这两种类型的成肌细胞不能产生表达MHCneo的肌小管，而不能解释体内观察到的MHC表型（表1）。不过在胚胎期非胎儿期观察到的MHCslow至少部分说明，不同成肌细胞的某些MHC表达方

14、向是遗传性的。由于培养过程中肌小管指示MHC表达的决定点，因此最终并未得出这些成肌细胞对决定成体纤维表型的作用（表1）。因此，很可能是不同类型成肌细胞对体内初级肌小管形成产生了可见差异。但是并没有直接证据说明这些不同的成肌细胞群决定了成体纤维类型。大多数情况下，这些不同的成肌细胞来源于不同年龄阶段的动物以及不同部位的肌肉。因此，成肌细胞差异性将启示我们不同微环境对成肌细胞性能的影响多过对成体纤维类型的预决定。这也暗示了依赖性与非依赖性成纤维细胞生长因子的存在可能是需要自主调节不同的成肌细胞群而非单单静止的、增殖或融合形成的肌小管15。5早期快慢亚型表达非协调通过分析其他成体肌纤维类型标记表达，

15、认为环境因素可能在决定纤维类型上的起到重要作用。Kaprielian和Fambrough9观察到胚胎期和胎儿期成肌细胞克隆培养可同时表达肌浆网膜Ca2- ATP酶快，慢亚型。虽然初级肌小管体内偏重表达慢亚型，但是次级肌小管表达相似水平的快慢两种亚型。这种结果从根本上与利用MHC抗体获得的有所不同，也不能断定最终纤维类型命运。得到的结论是特定纤维类型Ca2- ATP酶亚型限制性表达在初级和次级肌小管并非预先控制的，而是控制纤维成熟的。最好的解释就是一些环境影响胚胎后期Ca2- ATP酶特异性纤维沉淀表达9。尽管MHC和Ca2- ATP酶亚型在发育雏鸡体内的表达不相一致，有一点可以认为所有快，慢缩

16、蛋白亚型一旦形成功能单位将在调控中起到协同作用。研究表明了MLCs以及Tms快，慢缩亚型表达，但是快缩亚型表达占优势19,20。以这些 结果为基础加上在鹌鹑细胞探测的TnCs和 TnT mRNA， Hastings和 Emerson提出最初所有亚型都会表达，发育过程中由于快慢肌基因协同抑制导致特化作用的产生。忽略对所有收缩蛋白的综合分析，断定所有基因家族整体调控是否会发生是不太可能的。发育中的小鼠和人类四肢肌收缩蛋白亚型表达于近日检测到22。Sutherland等22分析早期发育中快，慢亚型mRNA含量上的协调程度。单纯从收缩蛋白基因表达的数量协调来预测：在发育的特殊阶段，如果某一快型基因表达

17、占成体水平30%，那么其他快型基因表达量也是其成体水平的30%。这一模式将成体纤维作为标准预测协调数量亚型基因表达。发现在体内初级肌小管不含有快慢亚型mRNA水平上的数量协调。却发现有一些快，慢，和心肌亚型的表达。次级肌小管形成与小鼠和人类四肢偏重快缩亚型表达的成对应关系，这预示着每一个收缩蛋白基因有其自身唯一的mRNA积累的决定因素22。结论是这些结果与成肌细胞规定快，慢缩蛋白不相容。也有观点认为四肢发育后期一些环境因素的影响协调抽缩蛋白基因表达22。快慢收缩蛋白基因协调表达过程也存在严重问题。肌细胞生成早期如果一系列亚型都表达，那么收缩蛋白之间表达量是如何维持的呢？蛋白成分在肌小管结构内是

18、严格组装的23，Drosophila最新研究表明肌动蛋白与肌球蛋白分解比例严重扰乱肌小管的结构24。分析培养的和胎儿期的人类肌小管以及成体骨骼肌为解决这一问题提供了一条可能方法25。我们发现肌细胞生成自始至终mRNA积累水平并未对快慢亚型进行协调调控，但是去发现每个基因家族在培养的肌小管，胎儿期肌小管，以及成体骨骼肌三种状态下总mRNA积累量相似。这一点与主要调控每一个基因家族mRNA总表达量的收缩蛋白量的维持相匹配。这表明，基因家族内存在个别独立的亚型相关mRNA表达量的协调机制25,以及一个协调亚型表达机制22。6甲状腺激素影响肌纤维成熟影响肌纤维类型的环境因素主要有两方面:激素作用以及神

19、经支配。有多篇文献认为不同激素的代谢产物对骨骼肌有影响26，但是只有甲状腺激素与纤维类型成熟速率有关。侏儒小鼠和激素注射研究方法都表明MHCneo到MHCadult fast基因表达的转换受甲状腺激素的影响27。特别说明，甲状腺激素的消失会明显削弱此种转换。相反，甲状腺激素的准确控制可以加速这种转换，并且这种促进作用独立于神经支配，这一点也说明了甲状腺激素对肌肉的直接作用28。另外，Izumo等29观察MHC亚型在成年鼠表达时对甲状腺激素敏感性，然而他们发现相同MHC基因在不同肌肉对甲状腺激素截然不同。因此认为甲状腺激素对纤维类型有益的说法不太可靠，但是确实在肌肉以一种特殊方式影响和调节MHC

20、亚型成熟表达。7肌纤维表型神经元控制与甲状腺激素相比，有强有力的证据表明神经支配决定纤维类型中的作用。Buller等30的经典研究揭示转换一条神经性慢收缩肌到一条由神经支配的快收缩肌，将导致肌肉转换为慢表型。反向试验也将一慢收缩肌转变为快表型肌。随后的研究表明这种结果至少部分解释了快慢神经的不同神经冲动样式31。Salviati等32报道慢肌纤维的快神经持续作用的慢肌纤维的神经支配将导致位于终端的由快神经组成的MHCadult fast减少。这些实验充分证实了神经支配在决定肌纤维类型上的指导作用。肌肉再生作为实验体系也被用来检测肌肉纤维类型的决定因子。在成体骨骼肌，发现靠近每条肌纤维肌纤维膜内

21、存在单核卫星细胞。当肌纤维损伤时，这些卫星细胞迅速增殖，根据损伤严重程度要么融合进入肌纤维，要么形成新的完整的肌纤维。当整块肌肉再生完全时将表现出初始的纤维表型33。在此体系下，特定纤维信息已知，且快或慢成体肌本质上均匀一致可用来分析其决定过程。对比神经参与否的肌肉再生，发现快,慢MHC亚型反应性存在区别。当没有神经参与慢肌纤维再生时，MHCaduIt fast表达，而有神经参与时，MHCslow成为仅有的表达亚型34。与预计结果相同，快肌纤维表达MHCaduIt fast无需神经参与，但是神经不参与时MHCneo淘汰率并不完全35。这表明神经参与可能影响MHCslow表达能力和MHCneo向

22、MHCaduIt fast转换，但是体内MHCaduIt fast表达无需神经参与36。体外神经参与MHCaduIt fast反应并不依赖于神经反应性的肌肉收缩。因此，神经可能在细胞培养中为开启MHCaduIt fast表达起到提供营养的作用，而这些营养同样也可以通过体内无神经来源物质而来。肌肉再生中神经对于调控MHC亚型表达的能力受肌肉原始胚胎的影响。Hoh 和 Hughes将颚肌移植到四肢的快肌或慢肌肌床上，使其在该肌床的适宜神经参与下进行再生。颚肌正常表达在四肢快慢肌上不会表达的MHCsuperfast亚型。研究发现再生颚肌受四肢快神经支配表达MHCsuperfast，而非MHCadul

23、tfast,但是慢神经最初感受表达MHCsuperfast和MHCslow，随时间仅有MHCslow得到保留。这表明纤维命运受一些颚肌独特的性能影响，比如成肌细胞或细胞外基质的性质。与四肢肌肉相比，颚肌具有特有的胚胎起源2，这可能也反映了体节内外成肌细胞存在根本区别的缘故。 神经支配对纤维类型决定的作用在发育过程中也得到了检测。Weydert等37观察到当MHCemb 和MHC F2B消失并非是由于肌肉层的神经参与的结果。生长期小鼠和雏鸡上的研究证明尽管MHCslowzai 某些肌小管内表达灵敏，但是初级肌小管初期表达的MHCemb和slow并非全部由于神经参与，然而初级肌小管内慢性表达的维持

24、很大程度上依赖于神经支配11,38,39。因此，这些研究更加强了神经对MHC slow表达的控制作用。8肌纤维多样性复合机制成肌细胞预决定和神经支配可能对于建立横纹肌表型中起到互补作用（表2）。有一点可以肯定的是，新生肌小管MHC亚型表达融合过程中受成肌细胞类型的影响。因此，本质上，啮齿动物成肌细胞可产生表达MHCemb和slow的肌小管，而单一的环境因素影响MHCneo的表达。次级肌小管用来表达MHCemb（并非MHCslow），而MHCneo表达受控于环境。一旦MHCslow表达开始，需要神经输入来维持，而这一点影响是真正有指导意义的。而神经输入停止，MHCneo和adultfast可能就

25、会表达，但是似乎这一过程尚需环境因素的影响。与肌肉再生有关的卫星细胞类似次级肌小管，有表达MHCemb而非MHCslow的倾向。这些细胞需要神经输入来选择MHCslow，次级肌小管也是如此。因此，MHC表达基础上成肌纤维为表型的建立反映了神经影响与肌小管早期决定向叠加的原理。虽然神经支配的准确本质尚不清楚，但是很可能在于提供营养因子或者影响肌肉收缩能力。由于研究数据欠缺，其他肌纤维收缩蛋白亚型的特殊表达的发生还是很复杂的问题。但是，来自小鼠和人类亚型表达的近期研究可给出一个可能的解释22。在人类和小鼠体内初级肌小管以及体外人类卫星成肌细胞优先表达某些分化初期表达的亚型22,25，而且这些优先表

26、达的亚型均自心脏，并非在成体骨骼肌内高水平表达。因此，肌小管收缩蛋白亚型初期表达顺应遗传规律，即纤维命运独立。需考虑到纤维命运的某些亚型早期重载以及亚型数量的协调表达，正如成体纤维内发现的那样只有在初期进程按规划进行时才可发生。除收缩蛋白亚型调控外，研究证实存在另一种区别先分类型的调控机制。Sutrave等40观察到鼠类MSV病毒导致的c-ski致癌基因缩短结构的引入与后肢（非隔膜的）F2B 和 F2x纤维选择性肥大相一致。某些类型的纤维肥大感应或排斥是由于MSV导致的纤维特异性随意表达或缩短的c-ski致癌基因特异性翻译的结果。因此，依据转换因子的激活表达参与将纤维种类进行分门别类而非仅划分

27、为快慢收缩类型。另外，由于不同肌纤维床大小不同，也可以按照纤维对引起细胞生长或肥大的因素的不同反应能力差异性进行分类1。虽然对缩短的c-ski致癌基因耐受的小鼠不会直接表达，但通过纤维类型转基因高水平表达与特异性肥大结果一致，证明类似c-ski的因子会参与生长信号传递。图表2.发育过程中MHC亚型表达和肌小管再生多重调控机制（源自雏鸡，小鼠，以及大鼠研究结论）9肌肉基因表达复合机制许多生物学家研究肌肉的最终目标是去识别直接负责调控发育中肌肉特定基因的分子物质。假设，我们知道每个编码特定类型纤维基因转录的控制因子，我们就能够在基因调控水平上阐明决定步骤。特别说明一点，对于成体肌内存在协同调控快慢

28、亚型基因的因子存在尚有怀疑。多个实验室研究工作开始了拆分转录调控肌肉激活子基因，但到目前为止尚未取得有关纤维类型决定的适用信息。然而有效数据表明这与多重机制有关。MyoD基因族与肌肉特定基因表达紧密相关42。MyoD相关基因编码非肌性细胞内的可一起肌肉特定蛋白表达的调控蛋白41,42。这些调控基因家族被认为是编码肌肉决定基因的候选基因，已成为综述的主要对象41,42，同时也是决定不同肌小管群特定类型纤维性质的候选基因。但是比较细胞培养中不同成肌细胞不同MyoD家族成员与MHC亚型表达并未发现清晰的联系43。另外，包含MyoD的限制位点的基因并非以特定纤维的方式进行表达41,42。与此同时，My

29、oD基因家族的作用在于联系肌肉特定基因表达的早期激活和维持。检测肌肉特定基因转录控制区域是相当复杂的8。肌肉肌酸激酶a-actin, a5k-actin, MLC1/3f, TnT, 以及TnIf激活子被仔细研究，提出了多重限制位点反式作用因子的异相排列8,44。大多数研究利用培养中的细胞来识别调控基因转录因子，细胞培养识别因子准确反映程度上存在以下潜在的问题：1）内源基因活性2）因子体内作用，例如ca和sk肌动蛋白激活子转入C2成肌细胞末端起到相同作用，而内源基因表达了非常不同的水平45。调控基因决定区或检测本身缺少将导致相应的转载基因和内源性基因失去活动能力。另外，研究发现细胞培养中并不重要的肌肉肌酸激酶基因区域却对转基因小鼠高水平表达非常重要46。最后，培养中的细胞基因转载可很好的明确新生肌小管内基因早期表达相关的区域。细胞培养中对特定纤维类型检测的缺少，有必要利用转基因小鼠来揭示相应的调控序列。这种情况下，Hastings等47证实转基因小鼠中导入编码特定纤维类型蛋白（TnIf）的编码基因，可适当调控表达过程。同时也证实了该方法的可行性，但是很显然通过分析碱基对来划定特定纤维调控区域有些不切实际。小鼠细胞培养鉴定出的调控区域可用来探测生物功能。虽然这对快速鉴定特定纤维调控区域很有用途，但是细胞