b第三章 目的基因导入细胞

1、基因工程基因工程第三章第三章 目的基因导入细胞目的基因导入细胞3.1 目的基因 基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的此类基因。这样的基因通常称这目的基因。目的基因主要是结构基因。3.1.1 结构基因组成作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子、基因编码区和转录终止子。启动子是DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。转录mRNA的第一个碱基被定为转录起始位点，这个碱基多数情况下是A，以此作为序列的+1，其上游的核苷酸序列为“-”，下游的核苷酸序列为“+”。基因编码区包括起译码A

2、TG、开读框和休止码TAA（或TAG、TGA）。终止子是一个提供转录停止信息的核苷酸序列。不同类型基因组的基因组成稍有不同，因此必须根据基因组类型和实验需要来分离含目的基因的DNA片段。3.1.1.1 原核生物结构基因的组成原核生物的基因多数以操纵子形成存在。完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启动子的调控之下，下游同具一个终止子，但各基因分别有起译码ATG和休止码TAA（或TAG、TGA）。操纵子除启动子外，往往还有一些调控转录的其他因子，如乳糖操纵子除启动子（p）外，还有调节因子（i）和操纵因子（o）。原核生物基因在起译码ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤核苷酸的SD保守序列区

3、，一般为AGGA，由此区转录的序列是翻译时核糖体识别、结合mRNA的位置。核糖体由此位置向前移动，寻找起译码AUG。原核生物基因转录终止之前有一段回文序列结构，称为终止子，使RNA聚合酶减缓移动或停止RNA的合成。但不是所有回文序列结构都是终止子。3.1.1.2 真核生物结构基因的组成真核生物染色体基因组的基因是单独存在的，并且两个基因之间有很长的间隔序列区，甚至起译码与休止码之间除编码序列区外还有一至多个非编码序列间隔区，称为内含子，而编码序列区称为外显子。真核生物结构基因的转录启动子通常包含3个保守序列区：在-20至-30序列区有一个TATA框，DNA双链在此外开始解开；在-75序列区有一

4、个CAAT框，其作用是与RNA聚合酶结合有关；在更上游处有一个GC框，是某些转录调控因子结合的序列。对真核生物基因转录的终止信号和终止过程了解甚少。不过发现高等真核生物结构基因休止码序列下游有一保守的AATAAA序列提供转录产物的释放信号。此外，真核生物染色体基因组的结构基因不具SD序列区，核糖体与转录的mRNA结合靠mRNA5端添加的“帽”结构。3.1.2 分离目的基因的途径根据实验需要，待分离的目的基因可能是包含转录启动区、基因编码区和终止区的全功能基因，甚至是一个完整的操纵子或由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；也可能是只具基因的编码序列，甚至是只含启动子或终止子等元件的DNA

5、片段；不同基因组类型的基因大小和基因组成也各不相同。因此分离目的基因应采用不同的途径和方法。3.1.2.1 通过构建cDNA文库和基因组文库分离目的基因通过转录和加工，每个基因转录出相应的一个mRNA分子，经反转录可产生相应的cDNA（complementary DNA，互补DNA）。这样产生的cDNA只含基因编码序列，不具启动子和终止子以及内含子。3.1.2.1 通过构建cDNA文库和基因组文库分离目的基因某生物基因组经转录和反转录产生的各种cDNA片段分别与合适的克隆载体连接，通过转导（转化）贮存在一种受体菌的群体之中。把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体称为该生物cDNA文

6、库。如果此群体只贮存某生物基因组的部分基因的cDNA，则称为部分cDNA文库。随后通过分子杂交等方法从cDNA文库中钓出含目的基因的菌株。用此方法获得的目的基因只有基因编码区，进行表达还须外加启动子和终止子等调控转录的元件。在生物体中，某种基因转录的mRNA在不同组织和不同发育时期的细胞内的丰度往往是不同的。mRNA丰度越高的基因越容易得到。因此为了获得某种目的基因，必须选用含这种目的基因的mRNA丰度高的组织来构建cDNA文库。包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这个群体称为这种生物的基因组文库。同样可以通过分子杂交等方法从基因组文库中钓

7、出目的基因。构建基因组文库的途径基本上与cDNA文库相似，主要区别是用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切，产生一系列大小不等的DNA片段，再与合适的克隆载体连接，转导或转化受体菌。这样构建的基因组文库中，有的受体细胞克隆了含有转录整套调控因子的全功能基因，甚至含有整个操纵子或基因簇；有的可能只克隆了启动子、或终止子、或基因编码区、或它们的一部分，甚至只是间隔序列。为了能克隆含有完整的全功能的基因或操纵子的大片段DNA，一般采用cosmid载体。因为cosmid载体可以承载30kb左右的较大外源DNA片段。如果已知目的基因的分子大小，或已知待克隆的DNA片段大小范围，则可先通过基因组DN

8、A酶切片段的凝胶电泳，回收大于待克隆的DNA片段，构建部分基因组文库，可以减少从文库中钓出目的基因的工作量。为了从cDNA文库和基因组文库中钓出目的基因，如果已经分离得到目的基因表达的蛋白质，那么可以先测定蛋白质的氨基酸序列，再根据氨基酸序列确定核苷酸序列，人工合成探针，同文库中的菌落或噬菌斑进行原位杂交，有明显杂交信号的菌落或噬菌斑就含有目的基因。3.1.2.2 用PCR技术从基因组中扩增出目的基因PCR（polymerase chain reaction, 聚合酶链式反应）是以DNA的一条链为模板，在多聚酶的催化下，通过碱基配对使寡核苷酸引物向3方向延长合成模板的互补链。PCR包括3个反应

9、过程：双链DNA变性（9095）成为单链DNA、引物复性（3760）同单链DNA互补序列结合、DNA聚合酶催化（7075）使引物延伸。这三个基本步骤重复进行，可以使特异性DNA的扩增率达到数百万倍（2106）。该过程见图2-10。如此经过2530次循环，产生大量待扩增的特异性DNA片段，足够用于进一步实验和分析。图2-10 PCR反应过程的原理PCR是目前分离筛选目的基因的一种有效方法。若已知目的基因两侧的20个以上的核苷酸序列，则可设计和人工合成一对寡核苷酸引物，扩增出含目的基因的DNA片段。3.2 目的基因导入受体细胞目的基因能否有效地导入受体细胞，取决于是否选用合适的受体细胞、合适的克隆

10、载体和合适的基因转移方法。3.2.1 受体细胞所谓基因克隆的受体细胞，是能摄取外源DNA（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，普遍被用作cDNA文库和基因组文库的受体菌，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主。目前用作基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广泛应用。真核生物细胞作为基因克隆受体近来已受到很大的重视，如酵母和某些动植物的细胞

11、。由于酵母的某些性状类似原核生物，所以较早就被用作基因克隆受体。虽然动物细胞也已被用作受体细胞，但由于体细胞不易再分化成个体，所以采用受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞，由此培养转基因动物。植物细胞作为基因克隆的受体细胞，有其优于动物细胞的特点，一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。由于这个原因，近年来植物基因工程发展非常迅速。3.2.2 目的基因片段组入克隆载体目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的基因的DNA片段组入合适的克隆载体。为选用合适的克隆载体，必须注意以下几点：为了使组入的目的基因

12、能够在受体细胞中有效表达，应选用具强启动子的表达载体，除非目的基因本身已具备在受体细胞内有功能的强启动子。选用的克隆载体便于同含目的基因的DNA片段进行连接。根据确定的受体系统，选用相应的克隆载体，因为用作受体细胞的不同生物类型有各自适用的克隆载体。随着基因转移方法的不断发展，原来不能用于某种受体细胞的克隆载体，由于采用电击仪和基因枪等新的基因转移方法成为可用的载体。有时当克隆载体确定后，为了使含目的基因的DNA片段能组入克隆载体，往往还须对DNA片段末端进行适当的加工。根据实验设计，有了合适的克隆载体和含目的基因的DNA片段，则选用限制性内切酶切割，并用DNA连接酶连接，得到预期的重组DNA

13、分子。3.2.3 重组DNA分子导入原核生物细胞大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体，可以通过转化、转导和三亲本杂交等途径，把重组DNA分子导入受体细胞。3.2.3.1 转化途径携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并 在 其 中 稳 定 维 持 和 表 达 的 过 程 称 为 转 化（transformation）。DNA转化大肠杆菌的技术路线包括制备感受态细胞和转化处理。感受态细胞指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。为制备感受态细胞，在最适培养条件下培养受体菌至对数生长后期，离心收获菌体，将其悬浮在含CaCl2（50100mmol/L）的无菌缓冲液中，置冰浴中15min后

14、，离心沉淀，再次悬浮在含CaCl2的缓冲液中，4下放置1214h，便成为可用于转化的感受态细胞。转化过程：向新制备的感受态受体细胞悬浮液中加入重组DNA溶液，使CaCl2终浓度为50mmol/L，置于冰水浴中1h左右，转移至42水浴中放置2min，促进受体细胞吸收DNA，马上转移到37水浴中培养5min，加入适量LB培养基，37振摇培养3060min，就可以接种在选择培养基上筛选克隆子。3.2.3.2 转导途径通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程称为转导（transduction）。含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组DNA分子导入受体细胞，一般先须进行体外包

15、装。为此，根据噬菌体体内包装的原理，获得了分别缺D蛋白和E蛋白噬菌体突变株的两种溶源菌。这两种溶源菌单独培养，因各缺一种包装必备的蛋白质，所以体内即使有DNA也不能进行包装，因此细胞内积累了大量除一种以外的其他供包装用的蛋白质。如果在试管内混合两种溶源菌合成的蛋白质，D蛋白和E蛋白互相补充，就可以包装DNA或重组的DNA。其主要过程举例如下：（1）制备包装用蛋白质 培养溶源菌BHB2690（D蛋白缺失）和BHB2688（E蛋白缺失）至对数生长中期，诱导溶菌生长，混合两种培养物，离心沉淀，悬浮于合适的缓冲液中，快速分装（每管50l），置于液氮中速冻，贮存于-70冰柜，6个月内有效。（2）体外包装

16、 取包装物（50l）置于冰浴上升温，当其正要融化时加入重组的DNA，边融边搅，充分混匀后，置于37保温60min，加入少量氯仿，离心沉淀杂物。上清液中含有新包装的噬菌体颗粒，就可用来感染受体细胞，筛选克隆子。3.2.3.3 重组DNA分子通过亲本杂交转化大肠杆菌当重组DNA分子不能直接转化受体菌时，可采用三亲本杂交（triparental mating）转化法。被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌和含广泛宿主辅助质粒的辅助菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体菌细胞内，按照重组DNA分子携带的选择标记筛选克隆子。外源DNA通过上述3种方法导入大肠杆菌 的技术已趋于

17、成熟。其中有的方法经洗染修改可以用于蓝藻、固氮菌和农杆菌等其他原核生物的基因转移。3.2.4 重组DNA分子导入真核生物细胞由于核核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。因此，近年来经过探索，发展了多种适用于植物和动物转基因的方法。3.2.4.1 重组DNA分子导入植物细胞（1）用致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入植物细胞，整合到植物基因组DNA，随其复制而复制。根据这一特征可构建一系列Ti质粒载体，与含目的基因的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质

18、体共培养法和悬浮细胞共培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。叶盘转化法：将实验植物材料的叶片进行表面灭菌，用无菌的打孔器从叶片上取下圆形小片，接种含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌。由圆形小片长出的愈伤组织通过筛选培养和再分化培养就可以获得转基因植株。与此类似的方法是将致癌农杆菌接种在植物新产生的伤口同样可获得转基因植株。原生质体共培养转化法：取含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌，同刚再生细胞壁的植物原生质体进行短暂的共培养，使重组DNA导入细胞，经筛选和再分化培养获得转基因植株。悬浮细胞共培养转化法：此方法类似原生质体共培养转化法，不同的是首先建立植物悬浮细胞系。（2）重组DNA的直接

19、转移法为克服致癌农杆菌介导法的受体局限性，近来发展了电穿孔法、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法和花粉管通道法等，把重组DNA分子直接导入植物细胞。采用的克隆载体不限于Ti质粒载体。电穿孔法：细胞膜的基本组成是磷脂，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜被击穿，但还达不到细胞致命伤害。所以当移去外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。根据这一性质，植物原生质体同外源DNA分子混合，置于电击仪的样品室中，按预定的参数进行直流电脉冲处理，再通过常规的再分化培养和筛选，可获得转基因植株。为避免制备原生质体和原生质体再生植株的困难，近来用此技术直接处理具有完整细胞壁的植物细胞、愈伤组织和花粉粒，均取得一

20、定的效果。微弹轰击法：金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。利用这一特性，先将含目的基因的外源DNA同钨、金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。此方法可直接处理植物某器官或某组织，是当今普遍使用的植物转基因方法。激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下用激光处理细胞，处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。此方法最适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。多聚物介导法：聚乙二醇（PEG）、多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸等是

21、协助DNA转移的常用多聚物，尤以PEG应用最广。这些多聚物同二价阳离子（Mg2+、Ca2+、Mn2+）和DNA混合，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。花粉管通道法：将重组DNA涂于授粉的柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化尚不具有正常细胞壁的卵、合子和早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。此外还有人使用显微注射法和脂质体介导法进行转化。3.2.4.2 重组DNA分子导入哺乳动物细胞哺乳动物的细胞不易从周围捕获外源DNA，明显地影响了哺乳动物转基因的发展。看来通过研究发展了一系列能有效地将外源DNA分子导入哺乳动物细胞的方法，主要有以下几种。（1）病毒颗

22、粒转导法由于病毒的种类繁多，用病毒DNA或RNA构建的载体性质各异，所以转导的过程各有不同，主要有三种类型：1，带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上；2，带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞；3，虽然带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，但是被感染的受体细胞的基因组中已整合了病毒缺失的基因，所以没有必要用辅助病毒混合感染。（2）用磷酸钙转染法哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。先将待转染的重组DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，随后逐滴缓慢地加入Heper

23、s-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙沉淀，粘附在培养的细胞表面上，达到转染目的。（3）DEAE-葡聚糖转染法DEAE-destran（二乙胺乙基葡聚糖）是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA分子。基本操作过程主要有两种方式：其一，先使病毒的DNA直接同DEAE-葡聚糖混合，形成DNA-DEAE-葡聚糖复合物，再处理受体细胞；其二，受体细胞先用DEAE-葡聚糖溶液预处理，随后再同DNA接触，也可达到转染目的。（4）聚阳离子-DMSO（二甲基亚砜）转染法用聚阳离子（polybrene）处理哺乳动物细胞，使细胞表面增加对外源DNA的吸附能力，再用25%30%DMSO处理细胞

24、，增加膜的通透性，提高对DNA捕获量，达到有效的转染。（5）脂质体介导法脂质体（liposome）是由人工构建的碗脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA导入受体细胞。包装成脂质体的SV40-DNA的转染率比裸露的DNA的转染率高出100倍。如先用PEG处理培养的受体细胞，使其易吸收培养基中的脂质体，可提高转染率1020倍。在正常情况下，每个细胞平均可吸收1000个左右的脂质体。这是哺乳动物转基因研究中常用的方法之一。（6）显微注射转基因技术鉴于哺乳动物细胞便于注射的特性，常应用显微注射法把外源DNA分子直接注入细胞。获得稳定转化子的数量取决

25、于注射的DNA分子。用pBR322/HSV-1tk重组DNA分子注射，转化率不到0.1%，而用连接SV40-DNA某些序列的pBR322/HSV-1tk重组DNA注射，转化率可高达20%。此外，为便于操作，也可采用“穿剌”法。处于细胞周围的DNA随微针穿剌形成的小孔进入细胞，或随穿剌的针头带入细胞。（7）电穿孔法其原理和操作过程类似植物细胞的电穿孔转移DNA的方法。3.3 克隆子的筛选和鉴定受体细胞经转化（转染）或转导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，已建立了

26、一系列筛选和鉴定的方法，主要有以下几种方法：3.3.1 利用载体携带的选择标记基因筛选克隆子3.3.1.1 利用抗菌素抗性基因进行筛选不同克隆载体通常分别携带Ampr（抗氨苄青霉素）、Cmpr（抗氯霉素）、kanr（抗卡那霉素）、Tetr（抗四环素）和Strr（抗链霉素）等抗性基因。当含任何一种抗菌素抗性基因的载体处理不具这种抗性基因的受体细胞，并在含相应抗菌素的培养基上培养时，只有获得载体的受体细胞才能继续生长，这样便可筛选出含克隆载体的克隆子。 要筛选含目的基因的克隆子，可选用具Ampr和Tetr这样的双抗选择标记载体，把含目的基因的DNA片段插入其中之一的Tetr选择标记基因区，导致该基

27、因的插入失活。用这样的重组DNA处理不抗Amp和Tet的受体细胞，先在只含Amp的培养基上培养。结果是含重组DNA或只含克隆载体的受体细胞均能长成菌落。随后从每个菌落取一部分再接种在含Tet的培养基上培养，能继续生长的是被克隆载体转化的克隆子，而被含目的基因的重组DNA转化的受细胞不能生长。据此可以从原来仍保留的系列菌落中筛选出含目的基因的真正克隆子。3.3.1.2 利用乳糖操纵子lac Z基因筛选克隆子完整乳糖操纵子的菌体能翻译-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和乙酰基转移酶（A），当培养基中含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）时，可产

28、生蓝色沉淀，使菌落成蓝色。如含乳糖操纵子缺陷型（lac Z）的载体转化互补型菌株，在含X-gal和IPTG的培养基中培养，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。当含目的基因的DAN片段插入lac Z基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。由此可以根据菌落的蓝、白颜色筛选出目的基因的克隆子。为区分含目的基因的克隆子与未被转化的受体菌（白色菌落），可在培养基中添加克隆载体选择标记的其他药物。lac Z蓝白斑筛选3.3.2 利用报告基因筛选克隆子对于那些不宜用克隆载体选择标记筛选克隆子的受体细胞，往往在含目的基因的DNA片段与克隆载体连

29、接之前，先在目的基因上游或下游连接一个报告基因。这样的重组DNA导入受体细胞后，可根据报告基因的表达产物筛选克隆子。常用的报告基因有GUS（葡萄糖苷酸酶）基因和LUC（荧光素酶）基因，利用这些基因产物催化特定底物的反应产物筛选出克隆子。此外，NPT-（新霉素磷酸转移酶）基因和CAT（氯霉素乙酰基转移酶）基因也可用作报告基因。3.3.3 克隆子的进一步鉴定用上述方法筛选的克隆子，难免得到一些假阳性克隆子。为进一步鉴定克隆子的真假，可采用限制性内切酶分析、分子杂交PCR扩增和DNA测序等方法。3.3.3.1 限制性内切酶分析法这是一种最简单也是最常用的方法，从克隆子提取DNA，经凝胶电泳检测，若出

30、现外源DNA带，可初步认定是克隆子；在此基础上，回收外源DNA，根据实验设计选用一些限制性内切酶切割，进一步用凝胶电泳检测，如果检测结果同原来用于转化的外源DNA被这些酶切割的结果一致，则可认为是真的克隆子。3.3.3.2 分子杂交法根据实验设计，先制备含目的基因的DNA片段的 探 针 ， 随 后 采 用 斑 点 杂 交 或 D N A 印 迹（southern blotting）等方法进行鉴定。（1）斑点杂交法提取待鉴定的克隆子的总DNA，直接固定在用于分子杂交的膜上，用上面制备的探针与其杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆子，与此类似的有菌落杂交法和噬菌斑杂交法。所不同的是菌落和噬

31、菌斑直接转移到用于分子杂交的膜上，先以降解和变性处理后，再用探针进行杂交。（2）southern杂交法斑点杂交、菌落杂交和噬菌斑杂交只能说明克隆子中含目的基因，但不能显示目的基因定位在受体细胞内的染色体基因组上还是其他基因组上。DNA印迹法则可对它进行定位，方法是先把提取的总DNA经凝胶电泳使不同大小的DNA分子分开；或者某种DNA分子先用限制性内切酶切割成不同大小的DNA片段，再用凝胶电泳分开；随后把分开的DNA分子或DNA片段转移到用于杂交的膜上，用探针与其杂交。制备DNA探针早期用放射性同位素进行标记，如32P标记。这样的探针灵敏度高，但有效期短，并且担心放射性污染。后来发展非放射性标记

32、探针，对生物素标记探针、地高辛（Dig）标记探针、荧光素标记探针以及光化生物素标记探针和光化DNP标记探针等。虽灵敏度略低于放射性同位素标记探针，但安全、有效期长，便于操作和保存。southern杂交3.3.3.3 PCR法根据含目的基因两端或两侧已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因，是真的克隆子。此方法的优点是灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基因。而采用DNA分子杂交的方法，只要在被杂交的DNA中存在目的基因的一部分DNA序列，就会出现杂交信号。3.3.3.4 DNA测序法以上方法可确定克隆子

33、是否含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作过程中是否发生了变化，因此必须对目的基因进行核酸测序。如果待测序的目的基因比较大，测序有困难，也可用RFLP（限制性片段长度多态性）技术。用限制性内切酶对原目的基因和已克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果不一致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，或克隆目的基因的核酸序列发生了变化。经多种内切酶切割分析，若两者结果一致，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核酸序列没有变化。3.3.3.5 目的基因转录产物检测通过克隆子筛选和鉴定，证实含目的基因的DNA片段已随克隆载体进入受体细胞，以不同方式进行复制。但还须进一步检测目的基因能否

34、在受体细胞内进行有效的转录。为此常用RNA印迹（northern blotting）法检测。根据转录的RNA在一定条件下可以同转录该种RNA的模板DNA链进行杂交的特性，制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总RNA杂交，若出现明显的杂交信号，可以认定进入受体细胞的目的基因转录出相应的mRNA。3.3.3.6 目的基因翻译产物的检测基因工程的最终目的是获得目的基因的表达产物。基因的最终表达产物是蛋白质（酶），因此检测蛋白质的一些方法可用于检测目的基因的表达产物。最常用的是蛋白质印迹（western blotting）法。提取克隆子总蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分离后，转移到杂交用的膜上，随后与放射性同位素或化学发光标记物标记的特异性抗体结合，通过一系列抗原抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，表明受