完成稿高效液相色谱

1、项目任务书2项目名称高效液相色谱分析方法知识目标1.掌握六种高效液相色谱分析方法的定义、分离原理、应用。六种方法分别为：液液分配色谱法、液固吸附色谱法、离子色谱法、离子对色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法。能力目标1.根据待测样品的结构和特点选择合适的液相色谱分析方法。2.培养学生独立阅读猎取知识的能力。3.培养学生具有良好的叙述表达能力。计划完成时间2015.9.17-2015.9.24完成形式小组代表发言+全班讨论+教师总结小组成员参考文献资料知识目标考核讨论课的形式进行，选择六个小组，分别由一名同学完成本小组所承担的分析方法的讲解，然后全班讨论。根据各小组完成情况，教师打分。分数（满

2、分5分）能力目标考核笔答：回答各不同种类样品所采用的高效液相色谱分析方法是什么？并分别回答该方法的分离原理。分数（满分5分）合计：心得考核办法：根据学生完成情况，教师打分。液液分配色谱法基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱。前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性化合物的分离。流动相和固定相都是液体，从理论上说，流动相和固定相用互不相溶，两者之间有一个明显的分界面，试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固

3、定液(固定相)中，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相之间进行分配，当达到平衡时，物质的分配同样服从于下式。 式中，K是分配系数，k为容量因子，和分别是溶质在固定相和流动相中的浓度，Vm和Vs分别是流动相和固定相的体积。原理液-液分配色谱法与气-液分配色谱法之间有相似之处，即分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大。在液-液色谱法中，一般为了避免固定液流失，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性，这种情况称为正相液-液色谱法。反之，若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液-液色谱法。后者的出峰顺序与正相液-液色谱相

4、反。为了更好的解决固定液从载体上流失的问题，将各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面上的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相，为色谱分离开辟了广阔的前景。应用 自20世纪70年代末以来，液相色谱分析工作大多在化学键合固定相上进行的，它不仅用于反相色谱法、正相色谱法，还用于离子色谱法离子对色谱法等色谱技术上。其中特别是反相化学键合相色谱法，由于操作简单，色谱分离过程稳定，加之分离技术灵活多变，已成为高效液相色谱法中应用最广泛的一个分支，而液-液分配色谱则极少采用液固吸附色谱法色谱分离是基于吸附效应的色谱法成为吸附色谱法以固体吸附剂为固定相以液体为流动相的

5、色谱法称为液-固吸附色谱法简称液-固色谱法。流动相为液体，固定相为吸附剂，这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的分离原理:当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子）于是，在固定相表面发生竞争吸附:X液相+ nS固相= X固相+ nS液相式中X液相和X固相分别表示在流动相中的溶质分子和被吸附作用吸附的溶质分子，S液相表示在流动相中的溶剂分子，n是被吸附的溶剂分子数。溶剂分子X被吸附，将取代固定相表面上的溶剂分子，这种竞争吸附达平衡时，有式中，K为吸附平

6、衡常数，亦即分配系数，上式表明，如果溶液分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应的减小。显然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值大。应用 液-固色谱法适用于分离相对分子适量中等的油性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。凡能用薄层色谱法成功的进行分离的化合物，亦可用液-固色谱法进行分离。缺点是由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。离子色谱法离子色谱法是在离子交换色谱法的基础上于20世纪70年代中期发展起来的液相色谱法，并快速发展成为水溶液中阴离子分析的最佳方法该方法利用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。通常以电导检测器为通用检测器为了消除流动相中强电解质背景

7、离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。例如在阴离子的分析过程中，试样通过阴离子交换树脂时，流动相中待测阴离子（以Br-为例）与树脂上的OH-离子交换。洗脱反应则为交换反应的逆过程。式中，R代表离子交换树脂。在阴离子分离中，最简单的洗脱液是NaOH，洗脱过程中，OH-从分离柱的阴离子交换位置置换待测阴离子Br-。若使分离柱流出的洗脱液通过填充有高容量H+型阳离子交换树脂的抑制柱，则在抑制柱上将发生两个非常重要的反应：由此可见，从抑制柱流出的洗脱液中，洗脱液（NaOH）已被转变成电导值很小的水，消除本地电导影响，试样阴离子则被转变成其相应的

8、酸，由于H+的离子淌度7倍于Na+，这就大大提高了所测阴离子的检测灵敏度。在阳离子的分析中，也有相似的反应。此时阳离子交换树脂作为分离柱，一般用无机酸作为洗脱液，洗脱液进入阳离子交换柱洗脱分离阳离子后进入填充有OH-型高容量阴离子交换树脂的抑制柱，将酸（即洗脱液）转变成水。上述双柱型离子色谱法又称为化学抑制型离子色谱法。如果选用低电导的洗脱液(流动相)，如1×10-45×10-4mol·L的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐等稀溶液，不仅能有效的分离、洗脱分离柱上的各个阴离子，而且背景电导较低，能显示试样中痕量F-,Cl-,NO3-和SO4-等阴离子的电导信号。该方法称为单柱

9、型离子色谱法，又称为非抑制型离子色谱法。离子型化合物的阴离子分析长期以来缺乏快速灵敏的方法，离子色谱法是目前唯一快速灵敏和准确的多组分分析方法，因而得到广泛重视和迅速发展。检测手段已扩展到电位检测器之外的其他类型检测器，如电化学检测器、紫外光度检测器等。应用范围也在扩展，从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸、核苷酸等均可用离子色谱法进行分析。离子对色谱法分析方法在色谱分离过程中，流动相中待分离的有机离子X+（也可以是带负电荷的离子）与固定相中或流动相中带相反电荷的对离子Y-结合形成离子对化合物X+Y-，然后两相间进行分配，Kxy是其平衡常数: 这表明，分配系数与水相中对离

10、子Y- 的浓度和Kxy有关。平衡常数Kxy取决于对离和有机相的性质。对离子的浓度是控制反相离子对色谱溶质保留值的主要因素可在较大范围内改变分离的选择性。离子对色谱法根据流动相和固定相的性质可以分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法。保留值随Kxy和Y-水相的增大而增大，平衡常数Kxy取决于对离子和有机相的性质。对离子的浓度是控制反相离子对色谱溶质保留值的主要因素，可在较大范围内概念分离的选择性。离子对色谱法，特别是反相离子对色谱法解决了以往难以分离混合物的分离问题，诸如酸、减和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺，生物碱以及药物等的分离。另外，还可借助离子对的生成给试

11、样引入紫外吸收或发荧光的基团，以提高检测的灵敏度。应用用于阴离子分离的对离子是烷基铵类，如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等；用于阳离子的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠等。离子交换色谱法离子交换色谱法是基于交换树脂上可降解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将他们分离。分离原理凡在溶剂中能够解离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。被分析物质解离后产生的离子与树脂上带相同电荷的离子（反离子）进行交换而达到平衡，其过程可用下式表示。阳离子交换：阴离子交换：从阳离子式中可以看到，溶剂中的阳离子M+与树脂中的Na+交换以后，溶剂中的M

12、+进入树脂，而Na+进入溶剂里，最终达到平衡。同样，在阴离子式中，溶剂中的阴离子X-与树脂中的Cl-进行交换，达到平衡后，此浓度表示的平衡常数Kx为分配系数Dx（阴离子交换）为对于阳离子交换过程，类推可得相应的K和D。分配系数D值越大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用越强。由于不同的物质在不同的溶剂中解离后，对离子交换中心具有不同亲和力，因此就产生不同的分配系数。亲和力高的在柱中保留值也就越大。离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交

13、换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配，固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。固定相离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式，一是常见的纯离子交换树脂。第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表

14、面层离子交换树脂，第三种为大孔径网络型树脂。它们各有特点，例如第二种树脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三种树脂适用于非水溶液中物质的分离，因为它们的孔径和内表面积大，不需要用水溶胀，便可满意地使用。典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交联共聚而成：其中，二乙烯基苯起了交联和加牢整个构型的作用，其含量决定了树脂交联度大小。交联度一般控制在4%16%范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，也较渗透，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离于基团。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂上具有与样品中阳离子交换的基团。阳离子交换树脂

15、又可分为强酸性和弱酸性树脂。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为磷酸基（一），其中和有机聚合物牢固结合形成固定部分，是可流动的能为其他阳离子所交换的离子。阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。阴离子交换树脂属强碱性，它是由有机聚合物骨架和一季胺碱基团所组成，它带有正电荷。而与相反的是可以移动的部分，它能被其它阴离子所交换。流动相离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶解度。离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合物配制：钠、钾、钡的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其相应

16、的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性缓冲液等。空间排阻色谱法空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)，是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学惰性多孔物质凝胶，凝胶具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，

17、而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点，被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。排阻色谱法也叫凝胶渗透色谱法、凝胶过滤色谱法。这种方法在1950年以后便开始应用起来。在交联葡萄糖凝胶出现后，由于可以测量较广范围的相对分子质量的分布，因此这种方法受到很大重视。最初，流动相主要只使用水溶液，所以采用凝胶过滤这一名词，继后用非水溶剂，所以采用凝胶渗透这一名词，他们的分离机制没有任何区别，统称为空间排阻色谱法。排阻色谱法的试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰，他们在柱内停留时间短，故柱内峰扩展就比其他分离方法小得多，所得峰通常都较