免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

1、免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项来源：生物谷 2008-6-27 访问量：9826评论(0) 分享一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓 度确定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS (1:1)。5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。7、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。二、注意事项

2、1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4c保存4h,时间过长，会使荧光减 弱。2、每次试验时，需设置以下三种对照：(1)阳性对照：阳性血清+荧光标记物(2)阴性对照：阴性血清+荧光标记物(3)荧光标记物对照：PBS费光标记物三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies 则是不同荧光信号标记的，我用 的是 donkey anti-rabbit-FITC (绿)和 donkey anti-rat-Tex-Red (红)。2、我的做法是两种primary antib

3、odies 同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉 primary antibodies 4 度孵育过夜比较好，背景比较干净。3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是 rabitt和rat的 IgG,荧光标记物对照是PBS或光标记物。4、Block用的血清使secondary antibody 来源动物的血清，我的是 10%E常 donkey 血清。5、其余同一般操作。原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白一诱导下，乙酰胆碱转移 酶（呈绿色荧光）和同源域蛋白Islet1（呈红色荧光）共存于细胞质内（激光扫

4、描共 聚焦显微镜观察）1. 一步双染色法先将两种荧光标己抗体按适当比例混合（A+B）,按直接法进 行染色。2.二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标 记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法， 结果A抗原呈现橘红色荧光，而 B抗原呈现黄绿色荧光。在应用中，常用的方 法是免疫荧光组织化学中间接法和 SABC-Cy3法相结合。例如，在实验设计时， 选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分 别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化一抗兔IgGo进行双重染色时，由于两种一抗 种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤

5、未结合的一抗，滴加二抗时， 先加人生物素化一抗兔IgG（二抗）孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧 光显微镜下观察已出现特异性荧光， 再进行FITC 一抗小鼠IgG（二抗）的孵育，最 后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。此法应注意 两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。 换言之，混 合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对 B抗原进行染色，否则会出现交叉 反应而使染色无特异性。双重免疫荧光标记法在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双 重免疫荧光标t己法（double immunofluorescence labeling method分为直接法和 间接法。(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显 微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直 接法简便可靠，但灵敏度较低。(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细 胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组 织或细胞，洗去多余的第二抗体，