标准菌株的制备

1、标准储存菌株和工作菌株制备作业指导书一、目的保证菌种经过较长时间保藏后仍然保持较强的生命力， 不被其 他杂菌污染， 减少菌株突变或发生典型的特性变化， 从而保证微 生物学检验结果的准确可靠。二、方法依据食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB4789.28-2013及附录 B标准储存菌株和工作菌株的制备。三、适用范围适用于本中心检验菌种 （大肠埃希氏菌、 产气肠杆菌） 的传代、 储存及工作菌株制备。四、名词解释4.1标准菌株（F0）:直接从官方菌种保藏机构获得。4.2标准储备菌株（F1）:将标准菌株在实验室转接一代以后得到的 一套完全相同的独立菌株。4.3储备菌株（F2）

2、：从标准储备菌株转接一代获得的培养物。4.4 工作菌株：由标准储备菌株、储备菌株或标准物质转接一代 获得的菌株。五、培养基和试剂5.1 营养肉汤5.2 营养琼脂5.3 乳糖蛋白胨培养液5.4 75%乙醇5.5 无菌水六、仪器设备6.1 生物安全柜6.2生化培养箱(37C, 44.5C)6.3 高压蒸汽灭菌器6.4 冰箱(4C, 20C)6.5 微型旋涡混合仪6.6 水浴恒温振荡器6.7 接种环6.8 酒精灯七、标准储存菌株的制备7.1 本中心所需标准菌株从认可的菌种中心购买，并要求生产商 提供验证报告。 冷冻干燥菌种为 0 代。本中心应做好符合性检查 并做好符合性检查并填写记录，做好文件归档。

3、7.2 菌种复活7.2.1 将标准菌株及已灭菌的培养基等用物移入生物安全柜。7.2.2 点燃酒精灯，在酒精灯火焰周围 5 厘米无菌区内，用砂轮 在距菌种管封口端 1/3 处划痕， 75%酒精棉球消毒菌种管外壁， 用无菌纱布包裹菌种管末端用力掰开。7.2.3 用无菌吸管吸取 0.5ml 适宜的液体培养基加大菌快上，混 匀成菌悬液。再将全部菌悬液移入含有 5ml 适宜的培养基的培养 试管中，在37C生化培养箱中培养12-18小时。7.2.4 取出培养试管，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明 菌种复活成长。形成第一代菌种（） ，各菌种适宜培养基及培养 条件见表 1.7.3 在适宜的固体培养基上进行

4、平板分离选择适宜的鉴别平板，用灼烧灭菌的接种环完全浸入复活的 培养基中， 取一满环接种物， 将接种环接触容器边缘 3 次去除多 余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为 200， 300。接 种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致， 整个划线应快速 连续。置于37 C生化培养箱中培养 24小时。7.4 菌种纯度检查和确认观察菌落形态是否符合， 同一平板上的单菌落的大小、 形状、 颜 色、质地、光泽是否相似。 对于出现两种或两种以上形态的菌株， 需要分离挑选目标菌株。各菌种菌落形态特征见表 1.7.4.2 革兰氏染色7.4.2.1 涂片：在载玻片上滴加一滴生理盐水， 用灭菌接种环取典 型菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。7.4.2.2 干燥：在室温中使自然干燥。7.4.2.3 固定： 将载玻片迅速通过火焰 2-3 次，以载玻片反面接触 皮肤，热面不烫为度。7.4.2.4 染色：滴加结晶紫染色液，染色 1 分钟，水洗7.4.2.5 脱色：滴加 95%乙醇脱色，约 30 秒，水洗7.4