超声波辅助热水提取香菇多糖及其应用的研究-4开题

1、附件3：北京理工大学珠海学院毕业设计（论文）开题报告题 目： 超声波辅助热水提取香菇 多糖及其应用的研究 学 院： 化工与材料学院 专 业： 生物工程 学生姓名： 毛颖 指导教师： 周新明 朱超锋 一、研究的现状及其意义香菇是世界第二大食用菌，味道鲜美，香气沁人，营养丰富，素有“植物皇后”美誉。因香菇营养丰富、味美纯香，为药食两用之佳品，我国国内市场每年有大量产品供应。香菇多糖作为香菇中的功能性成分之一，经研究发现具有抗肿瘤、提高免疫力、抗感染的作用，在降低血糖方面也具有良好的功效1-3。传统多糖一般采用水提法、酸碱溶液提取法等，得率较低，能量消耗大，而且在提取的过程中容易造成多糖降解，多糖活

2、性降低。超声波技术目前已被广泛应用到植物活性成分的提取中，超声波的振动能产生强烈的空化及搅拌作用，加速有效成分溶入溶剂，提高植物有效成分的得率。利用超声波技术提取真菌多糖的应用也比较广泛，超声波法提取效果较好4-5。利用超声波辅助热水浸提取香菇多糖技术目前报道较少，香菇子实体经粉碎后，使用超声波技术进行前期处理，再用热水浸提，可使多糖充分溶出6-7。本实验在时间、温度、料水比以及超声时间四个相关工艺参数单因素实验的基础上，利用正交实验和响应曲面对实验条件进行优化，并对香菇提取液进行纯化，抗氧化能力的测定和抑菌实验的测定。二、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题2.1 研究目标（1）探究最佳提取

3、香菇多糖工艺条件（2）研究香菇多糖对几种常见菌的抑制作用2.2 研究内容（1）采用超声波辅助热水浸提香菇多糖的方法，从料液比，浸提时间，浸提温度和超声功率等几方面探究最佳的提取工艺（2）用壳聚糖絮凝纯化香菇多糖，测定蛋白质的去除率和脱色率，确定合适的提取条件（3）探究香菇多糖抗氧化性能和对几种常见菌的抑制作用2.3拟解决的关键问题（1）使用鲜香菇还是干香菇的多糖提取率比较高（2）从香菇提取液中纯化香菇多糖，多糖的损失率需控制在合适的范围（3）提取液分量较小，如何进行浓缩三、研究的基本思路和方法、技术路线、实验方案及可行性分析3.1 基本思路通过正交实验和响应面实验对香菇多糖的提取条件料液比，浸

4、提时间，浸提温度和超声时间4个方面进行工艺优化，寻找最佳提取工艺。在最佳提取工艺的条件下用壳聚糖絮凝纯化香菇多糖，测定纯化前后的蛋白质去除率，脱色率和多糖的损失率，寻找最合适的纯化条件。因为香菇多糖有抗肿瘤活性，抗病毒活性，免疫调节性能等多种功效，在此我们测试其抗氧化性能和对几种常见菌的抑制作用。32 技术路线香菇清洗、干燥粉碎按一定水料比配成香菇溶液超声震荡热水浸提2 h冷却过滤取上清液硫酸苯酚法测定粗多糖含量确定最佳提取工艺壳聚糖絮凝纯化测定蛋白质去除率，脱色率和多糖损失率确定最佳纯化条件抗氧化性测试抑菌能力实验3.3 实验方案3.3.1 香菇多糖的提取和测定称取一定量的香菇粉末，按实验设

5、计的浸提时间、浸提温度、料液比条件进行热水浸提，然后抽滤，重复提取2次，合并滤液，滤液浓缩至原体积的1/3，加入3倍体积的95 乙醇，4醇析过夜。醇析液在常温下于4 000 r/min离心15 min，将沉淀物热风干燥，得香菇粗多糖。取一定量的香菇多糖粉末，复溶，定溶至一定体积，按照苯酚一硫酸法，测定490 nm波长下的吸光度，并根据多糖标准曲线方程计算多糖含量。设计正交实验和相应面实验，优化提取工艺表1 正交实验因素水平水平A料液比B超声时间/minC浸提温度/D浸提时间/h11：2010801.521：251590231：30201002.5表2 响应面分析实验因素水平表编码因素水平-10

6、1A料液比1：201：251：30B超声时间/min101520C浸提温度/80901003.3.2 壳聚糖絮凝纯化香菇多糖在香菇多糖提取液中加入一定体积的壳聚糖母液。在一定温度下，充分搅拌并静置一定时间后，4000 r/rain离心去沉淀，得澄清液，测定色素、蛋白质和多糖含量的变化。在室温条件下，固定壳聚糖沉降时搅拌速度为60 r/rain，沉降时间为60 min，通过改变壳聚糖的用量，壳聚糖沉降时间和溶液酸碱度的变化，考察壳聚糖用量对絮凝效果的影响。3.3.3 香菇多糖抗氧化性和抑菌实验（1）还原能力的测定：在10mL具塞试管中加入lmL样品、0.2mL磷酸钠缓冲溶液(0.2mol/L，p

7、H66)和0.5mL 1K3Fe(CN)6。置50恒温水浴中反应20min后流水速冷，再加入1mL 10三氯乙酸溶液，取反应液1.5mL，加3mL蒸馏水和0.2mL 1FeCl3，溶液，混合均匀，5min后于700nm处测定其吸光值，以水为空白，吸光值越大表示还原能力越强。(2）清除超氧阴离子自由基的测定:在比色管中加入Tris-HCl溶液(ph8.2)5.0mL，加入糖液lmL及50L邻苯三酚，迅速摇匀，以蒸馏水为空白对照组，每隔30s在325nm处测定吸收值。每个试样作3个平行样取其平均值。清除率按下式计算：清除率s()=(F空F样)/F空×100式中：F空空白溶液的吸光度随时间

8、的变化率；F样被测液的吸光度随时间的变化率。（3）清除羟基自由基(oH)的测定：利用H2O2与Fe2+产生OH在体系内加入水杨酸捕捉OH并产生有色物质，该物质在5l0nm处有最大吸收。反应体系中含8.8 mmol/L H2O2 l mL、9 mmol/L FeSO4 l mL、9 mmol/L水杨酸一乙醇l mL、待测溶液l mL，其中H2O2是最后加入并启动整个反应。37反应0.5h后，以蒸馏水为参比，在510 nm下测定吸光度。考虑待测溶液本身的吸光值不同，以9 mmol/L FeSO4 l mL、9 mmol/L水杨酸一乙醇lmL、不同浓度多糖溶液lmL和蒸馏水1mL作为待测溶液的本底吸

9、收值。清除率计算公式为：清除率()=Ao-(Ax-Axo)/Ao×l00式中：Ao不加糖液的空白对照液的吸光度；Ax加入待测溶液后的吸光度；Axo无显色剂时多糖的本底吸收值。(4) 供试菌种的活化及菌悬液的制备:预先将6种供试菌种接入相对应的斜面培养基上进行活化，细菌置37恒温培养箱中培养24h，霉菌及酿酒酵母置28恒温培养箱中培养48h，然后分别挑取一环已活化好的菌种放入9mL无菌生理盐水中，振荡摇匀。制成一系列菌悬液，浓度约为107-108cfu/mL，备用。滤纸片的制备：用打孔器将定性滤纸加工成直径为6mm的圆形滤纸片，放人干燥的平皿中干热灭菌后。浸入浓度为20mg/ml香菇多

10、糖供试液，浸泡30min。香菇多糖对6种食品常见菌的抑制作用:将固体培养基熔化倒入平皿，待冷却凝固后，分别加入0.2mL供试菌液。涂布均匀，做成含菌平板，用灭菌镊子夹出含有多糖的滤纸片放在培养基上。每皿贴4片。每菌做6次重复。细菌置37恒温培养箱中倒置培养24h霉菌及酿酒酵母置28恒温培养箱中培养48h，取出。测量滤纸片抑菌圈的直径大小，比较抑菌效果。3.4 可行性分析（1）香菇中含有大量香菇多糖（2）热水提取法稳定可靠，便于操作（3）提取香菇多糖的工艺比较成熟四、研究计划及进度安排2012年8月-9月 查找资料，设计实验方案，对比各种提取方法；2012年10月-12月 进行实验，再实验中改进方案；2013年1月-5月撰写论文，老师评点，修改，完成。五、参考文献 1王谦大型食用真菌的多糖类物质J广西轻工业,1995(4)：16-192王玢，任清，李奇，等香菇多糖的提取及其抗氧化性和保湿性评价J食用菌,2008(5):58-603李小定，荣建华，吴谋成真菌多糖生物活性研究进展J食用菌学报，2002，9(4)：50-584唐省三，朱晓琴复合真菌多糖的抗肿瘤及免疫增强作用初探J基础医学与临床，2004，24(5)：599-6005刘宁,李腱香菇多糖的提取工艺比较J.