贝类毒素的测定

1、贝类毒素的测定第30页，共30页。一、麻痹性贝类毒素（PSP） Para1ytical shellfish poisoning nPSP中毒是最常见的食用贝类中毒nPSP由一组石房蛤毒及其衍生物组成，PSP与涡鞭毛藻的水华有关（106个细胞升）nPSP在世界范围内分布 nPSP中毒引起神经系统紊乱，呼吸困难，感觉窒息，心肺衰竭而在224小时内死亡n一般PSP中毒在0.5-2h的时间内，症状逐渐发展，能承受12h以上的中毒者一般能康复 第30页，共30页。麻痹性贝类毒素的测定方法n国际上麻痹性贝类毒素的检测方法较多，主要有小白鼠法、高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等。n生物法(即小白鼠法

2、)是国际惯用的麻痹性贝类毒素的测定方法，已被美国公职分析化学家协会公定分析方法（AOAO）收入，而成为最普遍应用的检验方法。n生物法(即小白鼠法)，系采用ICR系列的小白鼠作为检验动物，进行贝类毒素分析n生物法(即小白鼠法)优势：当使用生物法检测法时，一旦发现超标样品，则本批样品不得食用，这说明所检测贝类中相关的毒素含量已经影响到人们的食用安全，不适合食用。第30页，共30页。麻痹性贝类毒素的测定生物法 (SC/T 3023-2003)原理n根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，计算确定每100g贝肉中PSP的含量n特点：测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的麻痹性贝类毒素的总量n鼠

3、单位 mouse unit，MU：对体重为20g的小白鼠腹腔注射1mL麻痹性贝类毒素后，小鼠在15min时死亡所需的最低毒素量 第30页，共30页。第30页，共30页。第30页，共30页。第30页，共30页。样品的测定检样的制备n贝类 洗净外壳，切断闭壳肌，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取贝肉，收集沥水5min（避免贝肉堆积），捡出碎壳等杂物，将贝肉均质 n注意：取肉时切勿割破肉体，开壳前不能加热或用麻醉剂第30页，共30页。样品的测定检样的制备n贝类罐头1.将罐内所有内容物（包括贝肉组织及汁液），于均质器中均质2.大容量的罐头，则过滤分离贝肉及汁液，分别称重，将固形物和汤汁

4、按比例混合，充分均质n冷冻贝类 在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的）呈半冷冻状态，按上述规定的方法清洗、开壳、淋洗、取肉、均质第30页，共30页。样品的测定提取n取 1 0 0 g 样 品 于 8 0 0 m L 烧 杯 中 ， 加0.1mol/L HCl溶液100mL充分搅拌，检查pH（pH应为2.0-4.0）。需要时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或0.1mol/L NaOH溶液调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素n将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节pH至2.0-4.0（切勿4.5）。将混合物移至量筒中并稀释至200mL第30页，共30页。样

5、品的测定提取n将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可n必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min，或用滤纸过滤n保留进行小鼠注射用的足量液体（约10mL）第30页，共30页。样品的测定小鼠试验n选择ICR系小鼠n称重：以感量为0.1g的天平将小鼠称重并记录重量第30页，共30页。样品的测定小鼠试验n每个样品注射3只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL提取液。注射时若有一滴以上提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠n记录注射完毕时间，仔细观察 并用秒表记录小鼠停止呼吸时 的死亡时间（到小鼠呼出最 后一口气止）第30页，共30页。样品的测定小

6、鼠试验n若注射样品原液后，1只或2只小鼠的死亡时间大于7min，则需再注射至少3只小鼠以确定样品的毒力n若小鼠的死亡时间小于5min，则要稀释样品提取液后，再注射另一组小鼠（3只），得到5min-7min的死亡时间n稀释提取液时，要调节pH至2.0-4.0,逐滴加入0.1mol/L或0.01mol/LHCl溶液第30页，共30页。结果的计算与判断n根据小鼠的死亡时间，在附录B 中查出相应的每毫升注射液的鼠单位数Mn 将存活鼠的死亡时间视为大于60min即相当于0.875MUn若试验动物重量19g或21g。则根据附录C查出重量校正系数kn样品中PSP的含量按公式（1）计算。（1） 式中： X样品

7、中PSP含量，每百克样品中鼠单位（MU / 100g） Ki每只小鼠的重量校正系数 Mi每只小鼠的鼠单位数，鼠单位（MU） D样品提取液的稀释倍数 200样品量，克（g）第30页，共30页。第30页，共30页。第30页，共30页。结果的计算与判断毒力单位转换样品中的毒力单位的按公式（4）计算。F80g /100g400MU/100g （3） F=5式中： F毒素转换系数； 80g /100g样品中PSP限量，g /100g 400MU/100g样品中PSP限量，MU/100g第30页，共30页。二、腹泻性贝类毒素（DSP）Diarrhetic shellfish poisoningnDSP是由

8、于双壳贝类滤食含毒的涡鞭毛藻而引起n影响较严重的地区主要是日本和欧洲沿海国家，发病率高，引起许多国家地区的关注n受DSP中毒的症状表现为消化功能紊乱（腹泻、呕吐、腹痛），食用含毒贝类后30分钟至几小时出现症状，中毒者一般在3-4天康复，尚无死亡病例第30页，共30页。腹泻性贝类毒素的测定方法n在国际上对腹泻性贝类毒素的检测方法较多，主要有生物法、高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等n生物法（小白鼠法，Mouse bioassay）是最常用的一种方法第30页，共30页。 腹泻性贝类毒素的测定 生物法(SC/T 3024-2004)原理n用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩蒸干后

9、，再以1%吐温60生理盐水溶解残留物，注射小白鼠观察存活情况，计算其毒力试剂和材料n丙酮（分析纯）n乙醚（分析纯）n1%吐温-60生理盐水：称取1.0g吐温-60，溶于生理盐水（0.8%NaCl）中，并定容至100.0mL第30页，共30页。仪器和设备n旋转蒸发器n均质器n磨口烧瓶：圆底，500 mL，250 mL，100 mLn布氏漏斗：100mmn分液漏斗：具塞，500 mLn天平：感量0.1gn刻度试管：10mL，具塞n冰箱：0-5和-15- -20n注射器：1mLn注射器针头：8#n小白鼠：体重为16-20g的健康ICR系雄性小白鼠 第30页，共30页。检样的制备生鲜带壳的贝类n用清水

10、彻底洗净贝类外壳，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，切勿割破肉体n收集贝肉，沥水5min，捡出碎壳等杂物，迅速冷冻，贮藏备用n注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺（又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色）。开壳前不能加热或用麻醉剂冷冻贝类n在室温下，使冷冻的样品（带壳或去壳的）呈半冷冻状态，按上述方法清洗、开壳、淋洗、取肉第30页，共30页。检样的制备n可以切取中肠腺的贝类（扇贝、贻贝、牡蛎等），称取200g贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后细切混合做为检样，注意不要使中肠内容物污染案板n 对于尚未确定部位毒性的贝类及不易切取中肠腺的小型贝肉，可将全部贝肉细切

11、、混合，做为检样n为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作，移液管等用过的器材应在5%的次氯酸钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解；废弃的提取液等也应用5%的次氯酸钠溶液处理第30页，共30页。提取n取处理好的中肠腺，或200g贝肉置于均质杯内，均质2minn加3倍量丙酮，与样品充分搅拌均匀后，用布氏漏斗抽滤并收集提取液。对残渣以检样两倍量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液第30页，共30页。提取n将抽提液移入500mL的磨口烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，56）去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物n将浓缩液移入分液漏斗内，以100mL200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡(不能生成乳浊液)，静置

12、分层后，去除水层(下层)n用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移入250mL的磨口烧瓶中，减压浓缩(旋转蒸发器，35)去除乙醚第30页，共30页。提取n以少量乙醚将浓缩物移入100mL磨口烧瓶中，再次减压浓缩去除乙醚n以1%吐温60生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到10mL。此时1mL试液相当于20g去壳贝肉的重量，以此悬浮液做为试验原液第30页，共30页。小白鼠试验n振荡使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液n将每只小白鼠称重，每三只小白鼠为一组，分别将1mL试液注射到小白鼠腹腔中n同时，另取三只小白鼠作为对照组，注射1mL 1%吐温-60生理盐水于腹腔中n观察自注射开始到24h后的小白鼠 存活情况，求出一组三只中死亡两 只及两只以上的最小注射量n小白鼠注射腹泻性贝毒后的症状 为运动不活泼，大多呼吸异常， 致死时间长第30页，共30页。结果计算和表述n使体重16-20g的小白鼠在24h死亡的毒力为1个小白鼠单位（MU）n样品中DSP毒力的计算，按表1选择24h内死亡二只及二只以上白鼠的最小注射量及最大稀释倍数进行计算第30页，共30页。注射量与毒力