仪器分析选论16.5.2酶免疫分析技术

1、16.5.2酶免疫分析技术应化1305宋宇韡 332酶酶免疫技术的分类免疫技术的分类克隆酶供体免疫测定克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定均相酶免疫测定异相酶免疫测定异相酶免疫测定酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定：固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)组织切片或其它标本中抗原的定位分析组织切片或其它标本中抗原的定位分析 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量一、均相酶免疫测定法一、均相酶免疫测定法 酶蛋白与抗原或

2、抗体结合形成酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物酶标记物。 未未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离游离标记物。标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合结合标记物。标记物。Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）一、均相酶免疫测定法一、均相酶免疫测定法 基本原理基本原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。后，其中的酶活性将发生改变。 因此，不需对反应液中因此，不需对反应液中结合和游离结合和游离的酶标记的酶

3、标记物进行分离，物进行分离，直接测定直接测定反应系统中反应系统中总酶活性的变总酶活性的变化化即可推算出被测样品中抗原的含量。即可推算出被测样品中抗原的含量。Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）二二、非均相、非均相酶免疫测定法酶免疫测定法基本原理基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离方法分离游离的游离的和和结合的酶标记物结合的酶标记物，然后对经酶，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法

4、又可分为为液相液相和和固相酶免疫测定固相酶免疫测定。目前临床上多用固相。目前临床上多用固相酶免疫测定法。酶免疫测定法。Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）酶酶联免疫吸附试验联免疫吸附试验（ELISA）一、基本原理一、基本原理底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析包被包被将已知抗原或抗将已知抗原或抗体吸附在固相载体吸附在固相载体表面体表面反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234方方法类型及反应原理法类型及反应原理（

5、一）检测抗原的方法（一）检测抗原的方法 将将己知抗体己知抗体包被固相载体，待检标本中的相包被固相载体，待检标本中的相应应抗原抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体固相抗体- -抗原抗原- -酶标抗体复合物，根据加底物后酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。的显色程度确定待检抗原的含量。 1.双抗体夹心法双抗体夹心法 E固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体EE底物底物双抗体夹心法检测抗原双抗体夹心法检测抗原 适用于检测含有至

6、少两个抗原决定簇的多价抗原（1 1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2 2）加待检标本）加待检标本, ,温育，洗涤。温育，洗涤。 （3 3）加酶标抗体，洗涤。）加酶标抗体，洗涤。（4 4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。定性或定量。 2 2技术要点技术要点 E固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体EE底底物物（+ +）（- -）E EE EE EE EE EE EE EE EE E双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原2.双位点一步法检测抗原双位点一步法检测抗原 即在双

7、抗体夹心法基础上使用针对抗原分子即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上上两个不同表位两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。 EEE底物底物固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体双位点一步法检测抗原双位点一步法检测抗原 在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗E EE EE EE E（+ +）E EE

8、 E（- -）双位点一步法测抗原双位点一步法测抗原 如果待检标本中抗原浓度过高，如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成容易形成“钩状效应钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。稀释后重新测定。注意事项注意事项 EE底物底物固相抗体固相抗体标本（抗原浓度高）标本（抗原浓度高）酶标抗体酶标抗体E3.竞争法检测抗原竞争法检测抗原 酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。相同的结合力，二者竞争结合固相

9、特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈待检抗原含量呈反比反比。待检抗原量越多，酶标抗。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。量呈反比。 酶标抗原酶标抗原 EEEE固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）底物底物E竞争法检测抗原竞争法检测抗原（1 1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2 2）待测管中加待检标本和一

10、定量酶标抗原的混）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3 3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。越淡，表示标本中抗原含量越多。技术要点技术要点（+ +）E EE E（- -）E EE EE EE EE EE EE EE E竞争法测抗原竞争法测抗原（二）检测抗体

11、的方法（二）检测抗体的方法 将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原相应抗体与之结合，形成固相抗原- -抗体复合物，抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原形成固相抗原- -抗体抗体- -酶标二抗复合物，根据加底酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。物后的显色程度确定待检抗体含量。 1.间接法间接法 固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标二抗酶标二抗底物底物EEE间接法检测抗体间接法检测抗体酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG）

12、，因此该法只需要变换固相抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性（+ +）E EE EE EE EE EE E（- -）E EE EE E间接法测抗体间接法测抗体2.2.双抗原夹心法双抗原夹心法 将已知抗原包被固相载体，待检标本中的将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原结合，形成固相抗原- -抗体抗体- -酶标抗原复合物，酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。同双抗体夹心法。同双抗体夹心法。技术要点技术要点E固相抗体固

13、相抗体标本（含抗体）标本（含抗体）酶标抗原酶标抗原底物底物EE双抗原夹心法检测抗体双抗原夹心法检测抗体（+ +）（- -）E EE EE EE EE EE EE EE EE E双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体3.竞争法检测抗体竞争法检测抗体同竞争法结合抗原。同竞争法结合抗原。HBcAb和和HBeAb的测定均采用竞争法，但其的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。测定具体模式有区别。1 1原理原理（1 1）竞争法检测）竞争法检测HBcAb：将将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。

14、加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。量成反比。2 2技术要点技术要点固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE竞争法检测竞争法检测HBcAbHBcAb（+ +）E EE E（- -）E EE EE EE EE EE EE E竞争法检测竞争法检测HBcAbHBcAb（2 2）竞争法检测）竞争法检测HBeAb：将将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。，温育，洗涤。加入酶标加入酶标HB

15、eAb，温育，洗涤。，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。体含量成反比。固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体底物EEE竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb（+）（- -）E EE EE EE EE EE EE EE EE E竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb方法评价方法评价ELISA具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、应用范围广泛、无反射性同位实验设备要求简单、应用范围广泛、无反射

16、性同位素污染等优点。素污染等优点。发展最快、应用最广，普及。发展最快、应用最广，普及。 1病原体及其抗体测定病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊广泛应用于传染病的诊断。断。 2蛋白质测定蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。 3药物和毒品测定药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。霉素、吗啡等。酶酶免疫测定的应用免疫测定的应用酶增强免疫测定技术酶增强免疫测定技术EMIT将半抗原（或小分子抗原）与酶结合成酶标半抗将半抗原（或小分子抗原）与酶结合成酶标半抗原，

17、采用竞争法测定半抗原，即样品中待测半抗原，采用竞争法测定半抗原，即样品中待测半抗原复合物和酶标半抗原与相应抗体竞争结合，形原复合物和酶标半抗原与相应抗体竞争结合，形成待测半抗原复合物和酶标半抗原复合物。成待测半抗原复合物和酶标半抗原复合物。原原理理 当酶标半抗原与抗体结合后，抗体与所标记的酶当酶标半抗原与抗体结合后，抗体与所标记的酶密切接触，使酶的活性中心不受影响，其活性得密切接触，使酶的活性中心不受影响，其活性得以发挥，通过加底物测定反应系统中酶活性。待以发挥，通过加底物测定反应系统中酶活性。待测半抗原含量与酶活性成正比，即待测半抗原越测半抗原含量与酶活性成正比，即待测半抗原越多，酶活性越高

18、。通过建立标准曲线，可以求得多，酶活性越高。通过建立标准曲线，可以求得样品中半抗原的含量。该技术主要用于检测小分样品中半抗原的含量。该技术主要用于检测小分子或半抗原，在药物检测中应用最多。子或半抗原，在药物检测中应用最多。克隆酶供体免疫测定技术克隆酶供体免疫测定技术C CEDIA克隆酶供体免疫测定技术（克隆酶供体免疫测定技术（CEDIA）是利用充值）是利用充值DNA技术，制备技术，制备半乳糖苷的两个片段；羧基端半乳糖苷的两个片段；羧基端的大片段称为酶受体（的大片段称为酶受体（enzyme acceptor，EA），），氨基端的小片段称为酶供体（氨基端的小片段称为酶供体（enzyme donor，ED）。这两个片段本身均无酶活性，但）。这两个片段本身均无酶活性，但EA和和ED可以聚合成具有活性的酶。可以聚合成具有活性的酶。原原理理 CEDIA反应模式为竞争法。测定原理为标