课题3--血红蛋白的提取和分离1演示教学

1、课题3-血红蛋白的提取和分离1凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 样品的处理样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。血血每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多

2、少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质。的蛋白质。 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，利用具有小，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行分离。的凝胶，来进行分离。 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较

3、小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢; ;而相对分子量较大的蛋白质无法进入而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。分离。分离蛋白质分离蛋白质 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液pHpH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。

4、能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持pHpH基本不变。基本不变。 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。, , 利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的pHpH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察( () )和科和科 学研究学研究( () )磷酸缓冲液磷酸缓冲液带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移

5、的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的pHpH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离而实现样品中各种分子的分离。

6、琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-亚甲基双丙亚甲基双丙烯酰胺在烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲

7、基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。 （为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。 。由几条肽链组成。由几条肽链组成的的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩。因而掩盖了盖了，使电泳迁移率

8、完，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法教学反馈教学反馈 1凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小分子的大小 B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C带电荷的多少带电荷的多少 D溶解度溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（维持（ ）基本不变。）基本不变。 A温度温度 B pH C渗透压渗透压 D氧气浓度氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。）的电极移动。 A相同相同 B相反相反 C相对相对 D相向相向4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的）与氧气的运输有关。运输有关。 A血红蛋白血红蛋白 B肌红蛋白肌红蛋白 C肌动蛋白肌动蛋白 D肌球蛋白肌球蛋白BBBA5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。的含量最多。 A白细胞白细胞 B血小板血小板 C红细胞红细胞 D淋巴细胞淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗为防止