食源性致病菌及其检测技术的调查

1、食源性致病菌及微生物检测技术的调查报告目录前言11 食源性致病菌概述21.1 食源性致病菌的定义及种类21.2 食源性致病菌对人体健康的影响21.3 食源性致病菌引起的食品安全问题31.3.1 国际情况31.3.2 国内情况31.3.3 食源性疾病不断上升的原因52 国内外的食品微生物标准检验体系52.1 国外主要食品微生物检测体系52.2 国内主要食品微生物检测体系62.3 常见食源性致病菌检测执行标准62.4 国标中致病菌常规检测方法流程73 微生物检测技术的发展现状83.1 常规微生物快速检测技术现状传统计数改良法83.2 常规微生物快速检测技术现状快速检测微生物数量的新方法93.2.1

2、 ATP生物荧光法93.2.2 检测微生物产生的CO2量的方法103.2.3 电化学方法（电导率法或电阻抗法）103.2.4 颜色变化113.2.5 流式细胞技术113.2.6 热量法113.2.7 放射测量法123.3食源性致病菌快速检测方法123.3.1 显色培养基法123.3.2 免疫学方法123.3.3分子生物学检测方法154 小结16前言近年来我国食品安全频频出现问题，食品安全问题已经成为生活中不可不谈的话题。同时食品引发的中毒事故频发，媒体曝光度增加，消费者对食品安全的重视程度与日俱增，国家也加大了食品安全问题的整顿和监管力度。根据国家食品药品监管总局法制司19日发布的通知，国务院

3、已将食品安全法修订工作列入2013年立法计划。影响我国食品安全的最主要因素是微生物污染和化学性物质污染，而由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。化学污染监管，将进入长期化和制度化；食源性疾病，这一食品安全隐患因微生物性食物中毒事件屡次发生，它也不会再继续“潜伏”。在由卫生部、工业和信息化部、商务部、工商总局、质检总局、粮食局和食品药品监管局联合制订的2013年国家食品安全风险监测计划中，对食品微生物及其致病因子、食源性疾病监测制定了全面而详细的监控计划。食源性疾病逐渐也引起越来越多专家、学者的广泛关注，中国疾病预防控制中心的陈君石院士、刘秀梅教授等在多个场合多次倡议重视

4、微生物引起的食源性疾病。在这样的社会背景下，我国食源性致病菌检测链条的发展有着巨大的空间。快速而准确检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食品安全的首要任务。1 食源性致病菌概述1.1 食源性致病菌的定义及种类 我国食品卫生微生物检验项目包括一般性检验项目和致病菌两大类。一般检验项目包括菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母等指标。食源性致病菌，指在食品的加工和流通过程中引入的病原菌，这些病原菌在食品中存活、生长代谢引起食物的变质和破坏，同时有些病原菌分泌有毒物质，直接或间接导致人患病。常见细菌性食物中毒的病原微生物有：致病性大肠杆菌（特别是出血性大肠杆菌O157：H7）；沙门氏菌属；志贺氏菌；

5、致病性弧菌（包括：霍乱弧菌、副溶血性弧菌）；金黄色葡萄球菌及其肠毒素；近年来发现导致细菌性食物中毒的微生物越来越多，包括单核增生李斯特菌、空肠弯曲菌等。我国对菌落总数（包括霉菌酵母菌）和大肠菌群限量标准只规定最大限量，致病菌规定“不得检出”。1.2 食源性致病菌对人体健康的影响1.2.1 引起急性中毒。v在一般情况下，常引起急性中毒，轻者多以急性胃肠炎症状出现，如呕吐、恶心、腹痛、腹泻、发烧等，经过治疗可以恢复健康；但重者可出现呼吸、循环、神经等系统症状，抢救及时可转危为安；如贻误时机还可危及生命，有的急性中毒，虽经千方百计治疗，但仍给中毒者留下后遗症。 2.2 慢性中毒或潜在性危害。有些变质

6、食品中的有毒物质含量少，或者由于本身毒性作用的特点，并不引起急性中毒，但长期食用，往往可造成慢性中毒，甚至可以表现有致癌、致畸、致突变的作用。食用腐败变质、霉变食物除了可以引起急性中毒外，还具有极其严重的潜在危害。1.3 食源性致病菌引起的食品安全问题1.3.1 国际情况食源性疾病并不随经济发展技术进步而减少或消失，世界范围内食品安全恶性事件接连发生，食源性疾病未能受到有效控制。近年来，全球食源性疾病发病率呈不断上升的趋势。1996年日本发生了世界上规模最大的历时3 个月，波及40多个都府县，涉及上万人的大肠杆菌O157食物中毒。2000年日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件，中毒者逾万人。20

7、05年遍及整个东南亚的禽流感更为各国的食品安全部门敲响警钟。2011美国23个州爆发了活禽引发的沙门氏菌疫情，造成将近100人感染。法国的多起因食用李斯特菌感染的熟肉制品而引发的食物中毒事件。WHO统计，全球每年发生约15亿腹泻病例，导致约300万5岁以下儿童死亡，其中约70%是因为生物源性污染食品所致。美国疾病控制和预防中心（CDC）估计，美国每年由食源性致病菌造成大约7600万例疾病，3215万例住院治疗，5200例死亡；其中由已知致病菌引起的食源性疾病大约1400万例，6万例住院治疗和1800例死亡。澳大利亚每年因食源性疾病带来的经济损失可达26亿澳元。英格兰和威尔士每年约有2,366,

8、000 例病人，每年的医疗费和损失约为 3-7亿英镑。1.3.2 国内情况1.3.2.1 2010年-2013年第一季度，我国卫生部发布的全国食物中毒事件情况的通报2010年食物中毒原因分类数据汇总中毒原因报告起数中毒人数死亡人数微生物性81458516化学性4068248有毒动植物及毒蘑菇771151112不明原因229658合 计22073831842011年食物中毒原因分类数据汇总中毒原因报告起数中毒人数死亡人数微生物性78513314化学性3073057有毒动植物及毒蘑菇53154351不明原因2891815合 计18983241372012年食物中毒原因分类数据汇

9、总中毒原因报告起数中毒人数死亡人数微生物性56374916化 学 性2139519有毒动植物及毒蘑菇7299099不明原因25155112合计17466851462013年第一季度食物中毒原因分类数据汇总中毒原因报告起数中毒人数死亡人数微生物性62981化 学 性5757有毒动植物91759不明原因或尚未查明原因42071合计2475518汇总2010年-2013年第一季度，我国卫生部发布的全国食物中毒事件情况的通报，得到的数据如下：2010年-2013年第一季度食物中毒原因分类数据汇总中毒原因报告起数中毒人数死亡人数微生物性2211376547化学性961882131有毒动植物及毒蘑菇211

10、3859271不明原因79364136合 计60723147485由上述监测数据得出，从食物中毒原因来看，每年均为微生物性食物中毒事件报告中毒人数最多。主要是由沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、肉毒毒素、葡萄球菌肠毒素、变形杆菌、气单胞菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯杆菌、椰毒假单胞菌等引起的细菌性食物中毒。1.3.2.2我国最近一项食源性疾病主动监测情况中国最新一项食源性疾病主动监测显示，我国平均6.5人中就有1人次罹患食源性疾病。致病微生物引起的食品安全问题在我国屡见不鲜，一旦发生，对公众的健康危害是明确而广泛的。正如中国工程院院士、国家食品安全风险评估中心研究员陈君石所述

11、，我国食品安全问题的三大敌人依次是微生物引起的食源性疾病，农残、兽残、重金属、天然毒素、有机污染物等化学性污染以及非法使用食品添加剂，但我国对致病微生物引起的食源性食品安全问题尚重视不足。1.3.3 食源性疾病不断上升的原因饮食模式的改变，例如对生鲜食品和未彻底加热食品的偏爱、从食品的加工至消费间隔时间的延长、不在家中进餐时尚的流行等均是微生物性食源性疾病发病率上升的原因。新的致病微生物和那些以前与食品无关的致病性微生物也是一个重要的公共卫生问题。近期发生的多起因食源性致病菌造成的食品安全事件如下：（1）6月10日徐福记隔夜蛋炒饭毒倒百余员工，确定为由肠炎沙门氏菌引起；（2）眉山“6.13”公

12、共卫生事件（四川眉山300多名学生感染性腹泻）病因查明为沙门氏菌污染；（3）6月17日广州76名夜班工人集体食物中毒事件，确定为沙门氏菌感染引起。沙门氏菌是世界最常见引发食源性疾病爆发的病原菌。沙门氏菌是全球报道最多的、各国公认的食源性疾病首要病原菌，广泛发生于家庭、学校、公共餐饮单 位及医院。沙门氏菌主要感染禽类，人们食用了被沙门氏菌感染的禽肉而发生食源性疾患。世界卫生组织和联合国粮农组织微生物危险性评估专家根据大量资料，通过数学模型对鸡的感染与人的患病率的关系进行了预测评估，如宰杀后鸡感染率为20，预测每餐危险性为1.13人/10万餐次，预测年发病的危险性为2.94人/1万餐次。2 国内外

13、的食品微生物标准检验体系所有为检测食源性病原菌或毒素而研制的新的检测方法在常规用于食品检测之前都必须与标准化的微生物检测方法进行对比实验以确认其有效性。在美国，用于检测临床标本的检测方法都需要经过美国食品药品管理局（FDA）的评价和批准。然而，在食品检测中却没有类似的政府认证批准的要求。虽然 FDA 的食品安全和应用营养中心和美国农业部（USDA）等管理食品安全的联邦机构的确拥有评估食品检测方法的内在程序，单对有关这类检测方法的认证却大多来自外部的独立机构。目前已有许多国内和国际组织可以对食品检测方法进行认证。在美国，主要机构是 AOAC，通过 AOAC 认证的方法一般都被视为是“权威或标准”

14、的方法。2.1 国外主要食品微生物检测体系（1）国际食品法典委员会（CAC）（2）国际食品微生物标准委员会（ICMSF）（3）国际标准化组织(ISO)（4）美国食品药品监督局（FDA）（5）美国官方分析化学师协会(AOAC)（6）美国农业部（USDA）（7）加拿大健康署(HPB)（8）美国公共卫生协会(APHA)（9）北欧食品分析委员会（NMKL）（10）法国标准协会(AFNOR)标准（11）英国国家标准(BS)（12）日本国家标准(JIS)（13）韩国国家标准（KS）等2.2 国内主要食品微生物检测体系（1）国家标准(GB)（2）检验检疫行业标准(SN)、检验检疫行业推荐标准（SN/T）（3

15、）卫生行标(WS) （4）农业行标(NY) 等2.3 常见食源性致病菌检测执行标准目标菌参照标准备注大肠埃希氏菌O157：H7（1）GBT 4789.36-2008 食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7NM检验（2）GBT 22429-2008 食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验 酶联免疫法（3）SNT 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法培养法，酶联免疫法、PCR法沙门氏菌（1）GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验（2）GBT 22429-2008 食品中沙门氏菌、肠出血性

16、大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验 酶联免疫法（3）SNT 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法培养法，酶联免疫法、PCR法志贺氏菌（1）GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验（2）SNT 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法培养法，酶联免疫法、PCR法副溶血性弧菌（1）GBT 4789.7-2008 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验（2）SNT 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法培养法，酶联免疫法、PCR法金黄色葡萄球菌（1）GB 4789.10-2010

17、食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验（2）SNT 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法培养法，酶联免疫法、PCR法单增生李斯特氏菌（1）GB 4789.30-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验（2）GBT 22429-2008 食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验 酶联免疫法（3）SNT 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法培养法，酶联免疫法、PCR法空肠弯曲菌（1）GBT 4789.9-2008 食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验（2）SNT 186

18、9-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法培养法，酶联免疫法、PCR法2.4 国标中致病菌常规检测方法流程致病菌常规检验方法大致是：食品标本或临床标本单个可疑菌落选择性分离培养（过夜）选择性增菌（过夜）细菌生化鉴定（23天） 纯培养（过夜）检验报告血清凝集试验 微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。微生物检验中常用的生化反应有：糖酵解试验、淀粉水解试验、V-P试验、甲基红试验 、靛基质试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、尿素酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、三糖铁琼

19、脂试验、硫化氢-靛基质-动力琼脂试验。国家标准中的方法固然是最稳定最成熟的方法，但因其复杂费时，当某种致病菌的检测需要快速出具结果时，国标方法的弊端就会显现出来。为此，人们在传统的鉴定方法的基础上，不断地尝试研制和改进检测设备，研究和创新检测技术，以求快速准确地检测食品中的微生物含量。3 微生物检测技术的发展现状随着食品、药品、化妆品等工业和医学诊断等对微生物的控制和检验要求越来越严格，近年来出现了不少快速检测的方法及相应的自动化仪器，以达到产品质量的实时控制，缩短生产和发货的迟滞时间，优化库存管理等目的。3.1 常规微生物快速检测技术现状传统计数改良法（1）纸片法：培养基固体在载体上。省去制

20、作培养基的时间。1>原理试纸片将选择性培养基和吸水凝胶进行组合，二片塑料膜构成，上薄为盖，下厚为培养基。2>操作方法：检样稀释取1ml滴于下膜正中央盖上膜扩展器压成20cm2圆圈 37培养24h 计数(显色的斑点)3>优点：（1）可节约玻璃仪器、培养基；（2）可节省培养基等试剂的配置灭菌和玻璃仪器灭菌和清洗的时间、人力和费用；（3）因为有显色剂和小方格，计数方便；（4）节约稀释的繁琐动作；（5）可快速测试致病菌，节省大量的实验步骤；4>缺点（1）成本比传统方法要稍高些；（2）测试细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌时不能节约培养时间；（3）大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应

21、的问题，金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目前仅细菌总数纸片有一些用户。5>代表厂家3M、美国IDEXX、绿洲生化、北京陆桥、广东环凯等；（2）螺旋平板计数法：螺旋接种仪菌落计数1>原理自动旋转平板技术是在琼脂培养基表面倒一薄层样品，该仪器可使液体样品以螺旋转动方式分布。液体慢速流出后。随着平板的旋转从中心向边缘分布，样品分布非常均匀。这种方法可广泛用于细菌、酵母、霉菌及乳类样品中。样品倒入平板后，菌落数可以用激光菌落计数器来计数，即将光检测仪放置在仪器的底部，激光仪从上面自动扫描平板，当激光束通过菌落时，可以降低光的强度，从而检测出菌落的存在。2>优点与传统方法相比，

22、无需稀释梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。3>缺点（1）检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时；（2）需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。4>代表厂家英国DWS（WASP2螺旋接种仪），杭州迅数（全自动菌落技术仪）（3）滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测1>原理滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。是将样品通过一定孔径的滤膜,使微生物截留在滤膜上,再进行培养、计数。2>优点灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。3>缺点需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的

23、产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。4>代表厂家德国密理博、赛多利斯、国内（天津恒奥、天津奥特赛恩斯、杭州泰林）多为高仿进口产品3.2 常规微生物快速检测技术现状快速检测微生物数量的新方法3.2.1 ATP生物荧光法1>原理所有的生物体中都含有能够传达能量的ATP，检验ATP就可知道细菌数量及活性。而在微生物中，所含ATP量很少。如在荧光素酶、荧光物质与氧及镁离子存在的条件下，其光量与样品中ATP量成正比，凭此光量来检验食品中的微生物量。2>优点通常用于进行商业无菌检测。可大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。3>缺点（1）ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器

24、的清洗保养要求特别高；（2）客户通常怀疑假阴性的可能，特别是用ATP单个检测代替常规微生物和致病微生物检测，其风险是一定存在的。(如保温增菌时间不够，菌数未达到一定数量，取样量太小，由于培养基原因，目标致病菌未大量增菌等原因)4>代表厂家美国CHARM（Lum-T ATP卫生检测仪、）、美国Hygiena（System SURE Plus ATP荧光仪）、3M（Clean-Trace ATP荧光检测仪）、美国BioControl（ATP荧光检测仪）、德国Millipore（MicroStar快速微生物检验系统）、沈阳中科靓马；3.2.2 检测微生物产生的CO2量的方法1>原理由于二

25、氧化碳(CO2)是微生物生长过程中所产生的代谢产物，因而通过检测CO2浓度的变化可以判定微生物的生长状况。在此基础上，结合染色技术、新的光源和光传感器等技术，来检测微生物生长过程中所释放的CO2来达到检测目标微生物的目的。2>代表厂家美国Biolumix（实时快速微生物检测系统）、法国梅里埃（BacT/Alert微生物检测系统）3.2.3 电化学方法（电导率法或电阻抗法）1>原理当细菌生长繁殖时，将蛋白质、糖类等大分子物质分解成氨基酸、有机酸等带电荷的小分子物质，改变培养液的导电度。这样，测量电阻和导电度的变化，就可推算出样品原来的含菌数。2>代表厂家奥地利Sylab（Bac

26、trac4300自动微生物快速检测系统）、英国DWS（Rabit自动微生物快速检测系统）、法国梅里埃（Bactometer微生物检测系统）3.2.4 颜色变化1>原理微生物生长导致培养基pH值发生变化，培养基中加入因pH值变化而变色的指示剂，由光学检测器检测指示剂的颜色变化，记录达到突变点的时间。2>代表厂家美国Foss（MicroFoss微生物自动监测仪-原产商是美国biosys公司)，此仪器原理与上述的电化学方法相似，每种样品都需要做标准曲线。最致使的弱点是培养基必须从国外进口，需要购买原厂的预装培养基，一个检测成本高达20元以上，应用范围受限制，成本高昂。因此在我国目前还没有

27、用户。3.2.5 流式细胞技术1>原理流式细胞技术是一种以光学为基础的在复杂的基质中分析单个细胞的方法。悬浮在液体中的微生物通过激光束，光被散射并被微生物吸收，散射的宽度和自然特性作为微生物的固有特性，可以利用透镜和光电元件收集散射光，进而评估微生物的数量、大小和性状。2>代表厂家美国Foss（Bactoscan FC牛奶中总菌数快速检测仪）、法国AES（Bactiflow流式细胞分析仪）及美国Chemunex（ScanRDI和D-count微生物快速检测仪）。Bactoscan FC采用核酸荧光标记后上流式细胞仪，所以检测的是死菌和活菌，死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难

28、保养，灵敏度不够高。适合牛奶企业检测原奶中细菌总数，检测原奶曾经被多少菌污染过；法国AES、美国Chemunex公司采用的是活细胞荧光探针技术，活细胞经标记后上流式细胞仪被检出，检测的是活细胞，与国标的要求吻合，但比国标严格，此方法可以检测嗜冷菌、嗜温菌和嗜热菌，而国标法通常只检测嗜温需氧菌。是目前国际上正在认可的生物荧光定量检测微生物数量的两种方法之一。另一种是Millipore的MicroStar（基于ATP检测原理）。3.2.6 热量法1>原理测定培养过程中产生的微量热量，从而求得微生物量。2>代表厂家无商品化仪器3.2.7 放射测量法1>原理在放射性培养基中检测对放射

29、性底物的吸收。2>代表厂家无商品化仪器3.3食源性致病菌快速检测方法3.3.1 显色培养基法检测时间相对较快，结果准确，技术成熟，产品很多。1>原理在培养基中分别加入某种特定的无色合成底物，经微生物特异性酶的作用而释放出色原，呈各种颜色或荧光。2>优点（1）快速、简便、节省时间-大多数显色培养基只需在样品增菌后，分离培养18-24h，即可根据菌落的颜色作出初步的鉴定。（阴性-弃去；阳性-进一步鉴定）。（2）结果直观，一目了然（根据颜色判定结果）；（3）灵敏度高、特异性强，大大减少了后续的鉴定步骤（确证试验）；3>缺点存在一定的假阳性和假阴：97%的大肠埃希氏菌含有-葡萄

30、糖苷酶，约10%的沙门氏菌属中也含有此酶；不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培养基中阳性反应。提示：这是任何选择性培养基都无法避免的问题。与普通选择性培养基比较，显色培养基的假阳性、假阴性的机率相对要低得多。4>代表厂家法国科玛嘉、Thermo Fisher、北京陆桥、广东环凯、北京奥博星等。3.3.2 免疫学方法免疫学方法的基本原理是抗原和抗体的特异性反应。抗体技术比较易于自动化和降低成本。为了检测特异性微生物和微生物毒素，越来越多的抗体被应用于各种类型的免疫学反应。3.3.2.1 酶联免疫法（ELISA)1>原理酶联免疫法是一种固相免疫分析方法，它是把抗原抗体免疫反应的特

31、异性和酶的高效催化作用有机的结合起来的一种检测技术，它既可以测抗原，也可以可抗体。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 ELISA最常用的固相载体为微孔板，但其

32、他一些固相载体如试管、微孔滤膜等也在不同的ELISA中得以使用。ELISA对细菌的检测灵敏度为104-105CFU/ml,对毒素或蛋白质为ng/ml或是更低，所以在检测之前必须进行增菌培养或萃取。有些ELISA方法经过信号放大等改进后提高了灵敏度，如酶联荧光（ELFA）技术，经改进后使用荧光底物来增强敏感性。增菌后，自动化分析系统可在45分钟内完成一次酶免分析，而手工操作完成一次酶免分析一般需要几个小时。又如酶联凝集技术（ELISA ELCA），通过凝集放大来检测结合后的抗原-抗体复合物。2>优点（1）特异性强、灵敏度高；（2）检测结果迅速准确，重现性好，广泛应用于各种分析领域。3>

33、;缺点酶联免疫的缺点在于对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，且对结构类似的化合物有一定的交叉反应。4>代表厂家ELISA微生物检测试剂盒一直由欧美几家家大公司垄断了全球95%以上的市场，如法国梅里埃、3M、, 美国Neogen、美国Biocontrol等。一个96孔试剂盒，售价高达5000-6000元，非常无奈，但是ELISA是国外最流行的快速筛选技术，检测灵敏度、检测周期都比较理想，不过国内现在有公司专业在做这方面的试剂盒了。梅里埃的mini VIDAS快速筛检致病微生物的原理应用酶联荧光免疫法，最后测蓝色荧光（ELFA）。抗原（细菌、蛋白）的检测是应用夹心的技术，包被针上有抗体包

34、被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。3.3.2.2 免疫胶体金技术（GLISA）1>原理免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。当抗原抗体反应发生时，待检测的抗原（抗体）就会吸附到胶体金颗粒表面形成包被而被胶体金标记，显色程度与抗原含量成正比，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。胶体金检测条在临床诊断中广泛使用。方法成熟，使用简便。2>优点（1）检测方法简单而快速，增菌后的检测非常简单，约10分钟一般能完成；（

35、2）不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；（3）单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。3>缺点（1）一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用；（2）肉眼判读存在误差；（3）进口的检测条的价格比较高，通常要3090元。4>代表厂家胶体金微生物检测条在国内已经有不少产品，但用户并不多，主要是质量不稳定。外来的胶体金微生物检测产品比较多。国外品牌：美国杜邦（沙门氏菌、李斯特、O157快速检测试剂条）、美国Neogen（沙门氏菌和李斯特菌）；德国r-biopharm（沙门氏菌和李斯特菌）；国内厂家：上海快灵（沙门氏菌）3.3.2.3 免疫磁分

36、离技术（IMS）免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病菌发生特异性的结合，载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病菌不断得到分离、浓缩。IMS的原理类似于选择性培养基，即只允许目标菌生长，而其他细菌的生长受到抑制。但两者的不同之处在于选择性增菌培养基需要添加化学剂或抗生素来选择病原菌，而IMS采用抗体对细菌进行有选择的捕获。由于试剂本身带有一定的刺激性，因此可能对细胞造成损害，IMS对目标菌而言则较为温和；同时，选择性增菌步骤的减少也缩短了样品分析的时间。IMS已经被用于李斯特菌属、O157：H7、沙门氏菌属以及其他来自于食品、

37、环境和临床标本中的病原菌的选择。如美国ABI公司的BeadRetriever全自动微生物磁珠分选平台。3.3.2.4 乳胶凝集（LA）最简单的抗体检测方法是乳胶凝集（LA）。在乳胶凝集实验中，采用包被有抗体的彩色乳胶颗粒当与目标菌菌悬液混合后，如果悬液中有特异性抗原存在，就可以形成肉眼可见的凝集或沉淀。虽然凝集反应简便迅速，但灵敏度不高，反应约需要107CFU。但即便如此，它的灵敏度也比传统的血凝或细胞凝集试验提高了10-100倍。目前也有比较多的厂家在做此类产品用于致病菌的初筛，国外厂家：美国BD、美国Microgen；国内厂家：广州健仑、广东环凯。3.3.3分子生物学检测方法 3.3.3.1 PCR技术聚合酶链反应(P