2.生物大分子分离纯化技术1(精)

1、2第二章生物大分子分离纯化技术生化杨质分禽的特辣性：要求：分需方法简便，选择性好，效率壽，保持 生化杨质的分子结构和构型，分离方法尽量不影 响生化杨质的生杨活性。由于生化炀质一般都很脆弱，易受化学、场理因 素影响而变性，因而分需过程常要求在低湿.洁 净、温和的条件下进行。本章所提到的生物大分子主要是指蛋自质、酶 及核酸。4本章主要的内彖包括:生化及临床分析样的预处理。生杨样品的常规分离纯化方法，如透析、微 过滤、冷冻干燥及禽心技术；生场大分子的赴泳分离纯化技术；生杨大分子的色谱分需纯化技术；2.1生化分析样品的准备与预处理生化样品极其复杂，首先应对所关心的待测杨 处于生场体的哪一个部住所荻得原

2、始的样,并 对卖际分析之前应进行怠样的处理必须有所了解。62.1样醃的类型.采集及椽存 样品的类型生化及临床分析的样品对象非常广泛，分布于 动杨或人体的每一个部住。它们可以是内源性的 化合肠或外嫄性的化合畅。样芫的基质可以是简 单的血样.尿样，也可以是比较复杂的粪便以至 整个组织。这些基质非常复杂，常常由多相组成, 如血象和血细胞及多种分子量犬小不同的化合场。 彼分析对象的稳走性也变化极丸，有只能稳定存 益几分钟.对蛋匂酶极为敘感的肽类，也有几乎 是完全稳定的药场的代谢物。样品的采集对于给定的样醃。采集处理速度与样的代谢 活性与它们的化学和生化稳定性密切相关。尿液中各种样醃的浓度一般认为可稳走

3、几小肘。 组织样 般需要快遠冷冻以防止发生变化，采 样者应该有相应的样采集及保存的设务。81.血样成人平均含6L的血液、其中约55%的血浆和45%的细胞。血样的采集一般采取清晨空贩采 血，以避免饮食、运动、情绪等对血液成分的 彩响。动物一般采取禁食1216h后采血，一 般生化检脸所需的血液标本采取费脉抽血。7血样有全血、血浆和血清之分。102.组织样品组织样通常采自肝、肌由、肺、骨髓或肠。这类组织是代谢活性的，因此采样后几费之肉要牲液氮中或其它冷却和中冷冻O样品的毎存一般来说，任何生杨样品釆集后都应立即进行分 析。但由于种种原因，这往往是不可能的。样也 许需要运送到卖殓室，也许完成一个研克需要

4、所有 的样品同肘测定。任何在法律上有败的分析必须注朗保存可期及保存条件等。液氮12生场体液中许多成分保存在室温或4C下肘，由于 沉淀、蒸发、氧化或细菌的进攻等原因，其浓度会发 生变化。对于血淸样,若对其中的钠或血请自蛋勺 进行分析，多样品保存在-20C对，20天内不会发生 碉显的变化。有些成分在保存期问确实可以发生朗显 的变化，如儿黍酚胺,因此必须椽存于-20或-70C下， 必要肘可以加一些抗氧化利或酶抑制剂。让血浆 或血请与红血球接触对，由于酶篙性的改变成彼分析 对象在细胞内外分布的变化会使分析结果发生变化。 所以、一般要快速分禽成单一的相。11样的初步处理尽管许多化合杨在全血浆中更为稳定，

5、但另一 些，如氨基酸则应保存柱不含妥自质的溶液中。 许多样分析之前都要求除去妥自质 用于去除 蛋勺质的各种沅淀方法的比较见表：14常用妥匂质沉法方法的比较样品沉淀制沉淀制与样品的体枳分数人 Ml 浆（除 99%的蛋白质）三氯乙酸（10% W/V）*0-2二氯乙酸（6% W/W）0.7鹤酸盐-硫酸0.7硝酸（5% W/V）3.0硫酸锌-盘麵化顿2.0乙1.3丙酮1.4乙醇3.0甲酵4.()饱和硫酸铁约 3.0超翦心约除 98%0 匸下加热 10 mm约除 95 鳴红细胞提取液（除 97%的蛋口质）三氯乙酸（5% W/V）4.5三氯乙酸（10% W/V）3.X=氯乙酸（1,% W/V）3.3-w表

6、示质童，v農示体积.w/va示质量怵积比。2.1.2砾样品的准备酶是一种具有催化活性的蛋自质，它的催化活性 是其特征参数。任何分需纯化步骤都应考虑酶的生物 活性的保持问题。生理样品中酶的绝对浓度的测走从原理上讲是很简 单的，分析肘的主要问题是纯的酶标样的荻得。16酶在夭然界中总是存疫于很复杂的混合杨中， 通常一种细胞中可能含有成百上千种酶，为了了解 和分析一个复杂生理拝芫，如亚细胞麥、细胞或整 个组织中的酶，就必须将酶放农一个尽可能简单的 体糸中进行研克。通过对单一酶的硏克可以获得酶 对哪些底杨具有特异性、及应的动力学参数及酶作 用方式。所有这些数据对于研丸酶在复杂体糸中的 坊能是非常重要的。

7、在许多匪学及工业应用方 面.是否具有纯的酶制剂非當关键。15酶活性的够持要获得生理样応酶坊 能研克的可靠 数据 必须对 酶进行纯化。雀.整个纯化过程中如何保持酶的活 性是最关键的，细胞内酶在分需纯化过程中能抗 各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护环境中释枚出来后，它对每一步纯化步骤都很敘感,细胞膜酶对嫁解尤其做感。18可滚性蛋自质不论是存在于细胞质的还是细胞 彖内的，其蛋匂质浓度从100 mg/ml到高达400 mg/ml（线卷体基质内）。体糸中存在各种天然的还 原和（如谷胱甘肽）使蛋匂质保持高的还原电伐。其 它稳定利也存在，如不同的底杨及产物。在蛋勺 质纯化过程中组织彼玻坏，蛋匂质从它

8、们的保护 环境中释放出来.彼限制在不同部住的蛋勺水解 酶也同时彼释放出来。所以要对所关心的酶进行 保护，以防止其彼氧化、水解或不可逆变性。通过控制纯化过程中的pH、温度及有机溶剂的 使用可以防止酶的变性。所使用缓冲溶液的pH应 控制在68之间，并保持合适的需子强度使其可以 防止酶变性。柠纯化过程的温度吟低至15-25 C可 以使许多吟解过程减3-5o20酶在稀溶液中由于对甕皿壁或色谱填料的吸 附会引起变性。吸附使酶的四级结构解离而失 去活性，这种变性可以通过加入载体蛋勺来阻 止。比较需用的栽体蛋勺有牛血淸匂妥勺，或 商醃化的结构简单、分子量已知的合成蛋匂。我体蛋自选择条件：1.与酶之间无相互作

9、用；2分子量与酶的分子量爰至少12得，以便必要对 可以很方便地用排阻色谱将二者分需。19一些特球的反应令使催化活性部住的 活性丧 失一些。柱纯化过程中一些辅助因子的失去会使 酶的活性丧夾，为此可以在纯化缓冲液中加入辅 助因子。催 化活性 部住氨 基酸戎 基的共 价化学 修饰很 常见，最易彼修饰的氨基酸为半胱氨酸。R-SH+R-SHR-S-S-R22对蔬基氧化的防止：1. EDTA络合全属W子（非全属酶）2.加入含琥基迖和，如琥基乙醇、2,3二蔬基丙醇. 蔬基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等对蛋自质酶解的防止：蛋勺水解酶来自涪细胞的内部， 哺乳动场将其 包裝在溶酶体中，而在微生杨中.它们则存在于

10、质膜和细胞壁之间。在用细胞匀浆法制备酶提取 物肘会发生蛋勺水解酶的猝放，所以对其活性要 进行抑制。根据蛋勺水鮮酶的类型可以选用不同 的抑制剂O24常用蛋勺酶抑制剂1.氣代确酸二异丙酯(DEP)：可抑制丝氨酸蛋自酶,但在使用上DEP比较危险，因为它具有样发 性，并能进攻人的乙酰胆喊酯酶而影响人的神经 传导 C2.笨基甲基磺眺氟(PMSF)：非挥发性丝氣酸酶的 抑制剂，而且不与人的乙I胆喊酶作用。它还可 以抑制一些蔬基蛋匂酶及象酸肽酶。3.胃蛋自酶抑制素和甲(乙)酰-亮亮精三肽是酸 性蛋自水解酶类很强的抑制剂，彼抑制的酶有胃 蛋匂酶、组织蛋匂酶及酵母蛋勺酶A。23由于细胞质 中含有當达10% 15

11、%(W/V)的非 水成分，处在蛋勺质周囲的水分子不能自由流动 而使蛋匂质分子的结构加以稳定。在酶提取杨制 备过程中为了模拟这种情况，通常加入非水的亲 水分子：甘油或糖醇如葡萄糖、果糖、乳糖及山 梨糖醇。26在毎步纯化之后都要进行酶活性和妥勺质量 的测走。在纯化过程中酶的比活性(u/mg)逐渐增 加并最终达到最大。酶的粗提物要用硫酸镂或聚 乙二醇(PEG)进行分组泥淀加以浓缩，也可以用 色谱哌附，然后再迅速从色谱基质上解壽下来。沉淀的蛋勺质溶解症小的体积中，这样可由于浓 度高而JL稳定。离心法(500050000 g)很适合于 亚细胞组分及硫酸镂和PEG沅淀的酶的分禽。25生理样品中具有生杨活性

12、砾的制备1酶活性测定过程确定生理样芫中酶的活性一般都要经过以下几个 步骤：(1)酶及反应液的制备，反应液通常由一走浓度的 底杨组成，并有确走的温度、pH及其它催化反应所 需要的辅助因子；(2)柠酶加入反应液或将反应液加入到酶制剂中并 进行温育以引发反应，随后的测走都以引发反应的 对间为起A；(3)反应可以用不同的方式终止，最常用的方法是 使酶夾去活性；28(4)柠酶反应产场从酶和底场中分需出来；(5)测走和鉴走在特走的肘间内由酶反应所生成的产 物；(6)在有 些情况下酶的活性可以用反应速度法来测走;数据分析。272.样品的制备方法对所有的生场样品(组织、尿液.脳脊髓液及细胞 培养液等)柱分析之

13、蔚都要进行下述准备工作；(1)研兗对象的准备(如动杨)；(2)标本的采集；(3)由标本制备样;(4)标本或样的形态；(5)标本或样品的保存；(6)用于酶法分析样品的预处理；(7)标本是来自于研克对象的一部分，并作为研克的 代表。30从生理样芫制备具有生杨涪性的酶肘，主要应考 虑两种因素：1.选择什么样的生场样芫作为进行纯化的起始原料。 如：令有麥骨、组织、生杨液.微生杨细胞及从培 养液或发酵液中获得的单细胞生杨等；分需开的各 种细胞混合杨，经嫁鮮所猝扳出来的 亚细胞碎片， 它们 包括像线粒体类的 细胞麥及膜组 分或含可溶性 成分。对这类样品进行处理的第一步是不同细胞彖 的分禽及可溶杨与不溶杨的

14、分需，然后对膜成分进 行溶解，最后将不同种类的分子加以分需。292.样县应纯化到什么程度。传统的纯化法最终所得到的是均匀的蛋自质溶 液。样醃纯化的主要目的是能够分析单一的酶活 性而不受其它物质的干扰。但对有些研兗，其它 有活性成分的存在则是有利的或必要的。32(1)从组织或甕官制等样组织和彖官至少可以分为两部分，即细胞和细胞 内 成分。所感兴趣的成分可能存在于 上述两个部分 中的任何一个。将整个未损伤的细胞从稳定的小纤 维基质中分离出来要采用细胞筛选技术。通當所使 用的用于基质玻碎的方法(如切、剪、松碎)会迭成 一些细胞的玻碎，而利 用纯化的酶可以对基质进行 特辣方式的4如胶原酶可用来玻碎哺乳

15、动杨组 织。使用胰蛋勺酶及其它蛋勺水解酶也取得了 一定 的成功，这拝的方法所得到的是细胞的混合场，细 胞内成分中也包括了一些不溶性的碎片及加入的酶 和试剂。(2)从组织或器官培养液中制务样品经培养的样品通常可按类似于上面的方法进行。 值得注意的是要逹免由于外加的细胞内成分及培 养介质所产生的影响。因为它们中可能含有来自 于介质本身或在样品培养过程中所产生的具有酶 活性的杨质。34(3)从细胞培养液制备样品对在培养液中生长的哺乳动杨细胞或细苗等样 % ,在分析之前要将非细胞成分与细胞成分分开，细胞与培养液.的分禽采用低速禽心就可以卖现，上请液要进行酶活性分析，滤饼留下来用于溶解 和分析 o总之，

16、酶样応的制备区别于其它的生场丸分子， 其预处理过程相对较复杂，应根据实验的要求严 格进行每步操作。332.2生杨样醃的常规分富纯化方法2.2.1透析(Dialysis)透析是用于生杨大分子分离和纯化的一种简单而古 老的方法， 它是在渗透中既有溶剂流动又有滚质流 动的过程。操作：把待分需或纯化的样芫封入由半透膜组.成的 透析袋内，然后将袋子放入低禽子强度的透析液中 进行透析。根据半透膜规格的不同，只有膜内分子 量小于分子量阻截范囲的分子才可以透过膜进入透 析液中，从而卖现大分子与小分子的分壽或生杨大 分子的纯化36操作要点：为了加速透析的进程，一般莊透析的过程 中要进行连续搅拌，同对在透析篆内霧

17、下大约 透析袅总体积10%的空陳，以便使得迓析膜界 面两侧能逐过膜的分子滾度梯度加大。逸析平 衡的肘间一般为46小时，进一步透析需要换 液。考虑到彼透析的生杨分子较壽湿度下易变 性，透析一般在34。（：下进行。35透析膜常用的透析膜材料有犬棉胶、玫病纨以及纤维 素等。膜孔径的丸小可以有不同的规格，在医药 工业中常使用纤维素透析管，其分子量阻帆范囲 为1.0 x103-5.0 x104o38凌析管的选择：主要考虑分子董阻截范圏其次考虑管的尺寸37透析管的预处理透析管使用之前一般要进行运多的处理，以除 去诸如甘油、重全属需子、含硫污染杨及可能存 在的蛋匂或核酸水解酶类。40透析液最常用的透析液是水

18、，一定pH和离子强度的缓 冲液或壽分子惰性杨质的浓溶液。柱纯的水中透 析一般速度比较快.但有逢成生杨杨质活性丧失 的危险。所以，通常选择具有一定pH和禽子强度 的缓冲液作为透析液.有肘也可以选择壽分子惰 性物质的浓嫁液，因为壽分子不会进入膜内而 水分子可以自由出入膜孔。柱这种情况下，除了 正活的透析之外，由于膜内外激透压差的存在， 膜内JL多的水会逐析到膜外，直到内外渗逐压达 到平衡为止，因而，也具有浓缩样芫的功能,39it析的应用透析的主要用途是从生杨丸分子样中除去盐类或 其它小分子场质。1.在分需及纯化蛋勺质及菌肘经常要加入有机溶 剂 或无机盐类，如硫酸段或硫酸钠以沉淀蛋勺质 类生场大分于，由于生杨大分孑征沉淀的同肘会 不可避免地混杂有这些小分子，从而干扰生场大 分子的进一步纯化或性质鉴;t。透析法是除去这 些小分子的简便而有效的方法。42it析的应用2.用来除去与生场大分子结合较弱的小分子或禽子, 如全属禽子及酶的辅助因子NAD, FAD等