血液病检验技术实验指导

1、血液病检验技术实验指导实验一、活化凝血时间测定【实验原理】 同试管法ct测定。试验中加入白陶土-脑磷脂的悬液以充分激活因了xii 和x【，并为凝血反应提供丰富的催化表面，故称为活化凝血时间(act)；还可以避免因接触 激活阶段的不同结果带來的影响，从而捉高了木试验的敏感性和重复性。【试剂】1. 脑磷脂的制备 脑磷脂是将兔脑粉中的组织凝血活酶除去参与外源凝血途径的蛋白 部分后所得的磷脂，故乂称部分凝血活酶。取干燥兔脑粉l2g加25ml丙酮，放登2h后过 滤，将此兔脑粉加氯仿25ml,连续震荡2h,以滤纸过滤，滤液蒸发后为淡黄色蜡状物，刮 入玻璃研钵中，加12ml牛理盐水研磨成均匀乳剂，以每安瓶0

2、. 25ml分装。2. 4%口掏土悬液 口陶土 2g加入50ml牛理盐水屮，室温保存，用前摇动。3. 4%白陶土-脑磷脂悬液 将脑磷脂用巴比妥缓冲液作1： 50稀释后，再加等量4%白 陶土悬液混合而成。4°c可保存3天，用时充分混合。4. 巴比妥缓冲液 巴比妥钠11.75g、nac114.67g、0. lmol/l fi<j hc1430ml,加蒸憎水 至2000mlo此缓冲液冈应为7.3,否则影响试验稳定性。【操作方法】1. 在含4%白陶土脑磷脂悬液0.2ml的试管中注入受检全血0.5,轻轻混匀。2. 其余操作同试管法ct测定。【参考值】1. 70±0. 76 (1

3、. 14-2. 05)mino【临床意义】1. 同试管法ct测定，但较其敏感，重复性也较好，可检出因子wh c小于45%的亚临 床型血友病。2. 是监测体外循环肝素用量的良好指标乙一。实验二、血浆游离血红蛋白测定(邻一甲联苯胺法)【实验原理】邻一甲联苯胺在酸性溶液屮和过氧化氢与血红蛋白共同作川牛成氧化型 联苯胺，产住绿色一蓝色一紫色，其颜色的深浅与血浆游离血红蛋口的含量呈正相关。【试剂】1. 2g/l邻一甲联苯胺溶液称取邻一甲联苯胺0. 2g,溶于冰醋酸60ml,加蒸饰水至100ml,置于棕色瓶内于冰箱保存，色变暗应重配。2. 1%过氧化氢溶液用30%过氧化氢原液新鲜配制。3. 10%冰醋酸溶

4、液。取10ml冰醋酸,加蒸馆水至100mlo4. 血红蛋白应用标准液 将血红蛋白贮存液用生理盐水稀释成lonig/looml备用。5. 抗凝试管 取0. 2ml 100u/ml肝素于试管内，在80°c以下烘干，每管可抗凝2ml全血。【操作方法】1. 将抗凝全血分离血浆。2. 取试管3支，分别标明测定、标准和空白，分别加入血浆、应用标准液，再向 各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氮溶液各1.0ml,充分混匀，放置lomirio3. 于上述3支试管内分别加入10%冰酷酸溶液10ml混匀，用435nm波长比色，以空白 调“0”，读各管吸光度。4. 计算:测定管吸光度游离 hb( m

5、g/l) = x100标准管吸光度【质量控制】1. -切容器均应避免血红蛋口污染，标本勿溶血，否则可引起假阳性。2. 过氧化氢溶液浓度要准，新鲜配制。3. 联苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超过30%,否则均可引起吸光度降低。4. 标准液的加入量一定要准。【参考区间】40mg/l【临床意义】 血浆游离血红蛋白含量增加是血管內溶血的特征。血浆中血红蛋白含量 超过与血清中结合珠蛋白的结合能力时，其含量即可升高。微血管内溶血时，血浆游离血红 蛋白含量均明显升高。pnh为2002500mg/l,输不合血型后为1505000mg/lo温抗体型 自身免疫性溶血性贫血、镰状细胞贫血及地屮海贫血时血浆游离血红

6、蛋白可轻度或屮度增 加。血管外溶血则正常。实验三、血清结合珠蛋白测定(比色法)【实验原理】 血清结合珠蛋口 (up)是肝脏产牛的a2糖蛋白，它与游离的血红蛋白 (hb)具有特殊的亲合力，町形成稳定的hb-hp复合物，后者在弱酸性(ph4)条件下，具 有过氧化物酶的活性，测具活性町间接反映11p的含量。【试剂】1. 乙酸缓冲液0. 2mol/l (ph4) 称取乙酸钠(naac 3h20) 2. 8g,冰乙酸5. 7ml溶解, 加蒸馅水至500ml o2. 0. 1% (v/v)愈创木酚溶液 取lml愈创木酚溶液于500ml乙酸缓冲液中,加蒸係 水至 looomlo3. 0.3%过氧化氢溶液 临

7、川前配制。4. 0. 5g/l高铁血红蛋白液。【操作方法】1. 取静脉血分离血清，避免溶血。2. 取受检血清0. 4ml,与等量高铁hb溶液混合。3. 取上述混合液0. 2ml,加入于已预温（25°c）的愈创木酚5沁溶液中，再加入05ml 0.3%过氧化氢，于25°c水浴内作用8min,注意避光。每份标木均应双份同吋测定。4. 用蒸馆水调“0”点，440nm处读取吸光度。5. 由校正曲线杏出受检血清中hp含量。【质量控制】1. 受检血清要避免溶血。2. 电泳时温度不能过高，应把电泳槽置于冷水屮电泳。否则电泳效果差，区带不易区 分。3. 电泳液应经常更换，防止因ph及离子强度

8、改变对电泳效果的影响。【参考区间】0.21.9ghb/lo【临床意义】hp可与hb结合，以除去血循环中游离的hb。各种溶血性贫血，无论血 管内溶血还是血管外溶血，血清中hp含量均明显降低，甚至测不出。hp降低的程度与溶血 程度呈正相关，即溶血越严重，血清hp越低。如果血管内溶血超出hp的结合能力，即可出 现血红蛋白尿。动态监测表明,急性溶血开始，血循环中游离hb即迅速增加,随着hb-hp 复合物的有效清除，血清hp也随之恢复正常，因此血清hp与游离hb同吋测定对溶血性贫 血的诊断及疗效观察均具有重要意义。肝病、传染性单核细胞增多症和先天性无hp血症， hp亦降低，故诊断溶贫时应除外上述疾患。感

9、染、创伤、肿瘤、肝外阻塞性黄疸及类固醇 激素治疗吋hp可增加，这些情况下hp正常也不能除外溶血。醋纤膜电泳有助于区别血管内抑或血管外溶血。各种溶血性贫血患者hp均显著减少， 其至缺如，故电泳后无hb-hp |x带，而仅有一条未结合的hb区带。但显著血管内溶血（如 pnh）时，还出现一条高诙血红素白蛋白区带，而血管外溶血（如球形红细胞增多症）则无 此区带。实验四、尿含铁血黄素试验 （rou s test）【实验原理】含铁血黄素中的高铁离子（feb在酸性环境中与亚铁鼠化钾作用，生成 蓝色的低铁氧化铁，称为普鲁氏蓝反应。【试剂】1、20g/l亚铁鼠化钾水溶液，用时新鲜配制。2、3%盐酸。【操作方法】

10、取新鲜冰5ml离心沉淀，弃去上清，于沉淀中加入试剂和各lml,混匀。證室温lomin,再离心沉淀，取沉淀物显微镜检查。【结果判断】 如见到有分散或成堆蓝色颗粒(直径约13nm)即为阳性。存在于细 胞内更为可信。【质量控制】 所用试管、玻片、试剂均应防止铁剂污染，否则出现假阳性。每次试验 应做阴性对照。如两种试剂混合后即显深蓝色，捉示试剂污染简恢，不宜使用。晨尿阳性率 较咼o【临床意义】血浆游离血红蛋片经肾小球滤出示，被肾小管上皮细胞吸收、降解，最 后形成含铁血黄素，贮存于细胞内。当细胞脱落随尿排出，即成为含诙血黄素丿录。正常为阴 性。阳性主要见于慢性血管内溶血,尤其以pnh为多见。即使无血红蛋

11、白尿时也可呈阳性。 但阴性结果也不能完全排除血管内溶血，因含铁血黄素颗粒的肓径需1 u m时才能从镜下见 到。急性血管内溶血时，虽可有血红蛋白血症和血红蛋白尿，但还不能形成足够人的含铁血 黄素颗粒，需在数h后才阳性，并可持续数周。实验五、红细胞渗透脆性试验【实验原理】红细胞在低渗盐水屮，水分透过细胞膜内渗，使之膨胀破坏而溶血。本 试验是测定红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗力，以鉴别某些与红细胞形态有关的溶血性贫 血。红细胞对低渗盐水的抵抗力与其表而积和体积的比值有关，厚度越人，该比值越小，即 渗透脆性越人；反之，脆性越小。以浓度为横坐标，溶血度为纵坐标绘制illi线，找出50%溶 血对应的盐浓度

12、，即红细胞中间脆性(mcf),后者较皱感。【试剂】171mmol/lnacl(10g/l)溶液：将100°c烘干的分析纯氯化钠10g置于100ml 容量瓶中加少量蒸憎水溶解后，再加蒸憎水至刻度处。【操作方法】取12支试管，按5-1分别加入10g/l nacl和蒸镭水。表5-1红细胞渗透脆性试验操作表(国际单位制)试管号456789101112naclsig/'l6.86.46.05.65.24.84.44.03.63.22.82.4制mmol/l116.3109.4102.695.88& 982. 175.268.4 61.654.747.941.0浓度旧制(%)0.

13、 680. 640. 600. 560. 520. 480. 440. 40 0. 360. 320. 280. 2410g/l nacl(ml)蒸饰水(ml)然后各管立即加入新鲜静脉血各1滴，并从低浓度到高浓度逐管颠倒混匀，室温静置。1.71.61.51.41.31.21. 11.00.90.80.70.60.80.91.01. 11.21.31.41.51.61.71.81.9【结果判断】静置室温2h,观察结果，从高浓度开始，上清液呈透明红色阳管底有红细胞者为开始溶血管；溶液透明红色，管底完全无红细胞者为完全溶血管。【质量控制】1. nacl溶液浓度耍准确，故应干燥精称。2. 注射器和试管

14、必须清洁干燥。3. 应用新鲜静脉血，忌用抗凝血，必要时可用去纤维蛋白血或肝索抗凝血。4. 结果不易判断时可离心示观察。5. 黄疸病人开始溶血不易观察，严重贫血红细胞太少时均可用等渗盐水将红细胞 洗涤后再配成50%红细胞悬液进行试验。6. 每次试验均应做正常对照，与被检血相差0. 4g/l,即有临床意义。【参考区间】开始溶血：71. 878. 6mmol/l (4.246g/l)完全溶血:47. 854. 7mmol/l (2. 83. 2g/l) 中间脆性:68. 5-76. 2mmol/l【临床意义】患者比正常对照高6. 8mmol/l或中间脆性76. 2mmol/l有诊断价值。脆性增加：见

15、于遗传性球形红细胞增多症，也见于自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞 增多者。脆性降低：见于缺铁性贫血，各型地屮海贫血，hbc、d、e病，脾切除术示及阻塞性黄 疸等。实验六、酸溶血试验(hes test)【实验原理】正常人红细胞在酸化(p1i6.66. 8)的自身新鲜血清屮(内含补体和备 解素),经37°c孵育lh不溶血。而阵发性睡眠性血红蛋白尿(pni1)患者,因红细胞膜缺陷, 对补体溶血效应敏感性增强，则发生溶血。【试剂】1. 0. 2mol/l hclo2. 8. 5g/l nacl 溶液。【操作方法】1. 配制50%红细胞悬液 取10ml离心管2支，标明患者、对照，均加入&

16、; 5g/l nacl 溶液56ml,分别加入患者和对照者未梢血卜几滴，混匀，离心后弃去上清，如此重复洗 涤红细胞2次，最后配成50%红细胞悬液备川。2. 分离正常对照血清 取与患者同型或ab型血35ml,待自然凝固后分离血清。3. 按表6t操作。表6-1酸溶血试验操作表管别正常对50%红细胞0. 2mol/l孵育照血清悬液(ml)llcl(ml)患者对照试验管0.50. 0250. 0537 °c对照管0.50. 0250. 05水溶ih【结果判断】 试验管溶血，对照管不溶血为阳性；试验管和对照管均不溶血为阴性。【质量控制】1. 血清酸化后试管必须塞紧，否则c02逸出使血清酸度降低

17、。2. 抗凝剂屮的na、k可影响ph,故不宜川抗凝血，但可用脱纤维血。3. 为保证补体充足，最好用混合血清，但正常对照红细胞必须卅“0”型血。4. 多次输血者，可因血屮异常红细胞相对减少，木试验可呈弱阳性或阴性。【临床意义】正常人为阴性。阳性见于pni。遗传性球形红细胞增多症及自身免疫性溶 血性贫血也町呈阳性。主要与红细胞球形化有关。血清加热破坏补体，若本试验转为阴性则 更支持pnho实验七、蔗糖溶血试验【实验原理】低离子强度的等渗蔗糖溶液，在温育条件卜-可促进补体与红细胞膜的 结合，使红细胞对补体损伤的敏感性增强而导致溶血。【试剂】92. 4g/l蔗糖溶液。【操作方法】取新鲜抗凝血（枸椽酸盐

18、或草酸盐抗凝）05nil加入4.5nil蔗糖溶液屮， 混匀，置37°c孵育箱内30niin后离心，上清液呈红色为阳性，无色为阴性。【质量控制】注射器、试管应清洁干燥，避免溶血。无蔗糖可用10%荷萄糖代替。【临床意义】正常人为阴性。阳性见于pnii。本试验较ham试验敏感，是p1i诊断的筛 选试验，但特界性较差。再障-pnh综合征、巨幼红细胞性贫血、口身免疫性溶血性贫血也 可呈阳性。本试验最好与ham试验同时操作，用疋常血清代替患者血清做试验，可除外患者 补体异常所致的假阴性。实验八、热溶血试验【实验原理】利用患者的红细胞和自身新鲜血清（含补体），经37°c孵育后，由于葡萄

19、糖分解产酸，使有内在缺陷的红细胞溶解而溶血。【操作方法】抽取静脉血l-2ml,取卜针头，沿管壁缓缓注入小试管内，避免产牛气泡, 置37°c孵育箱保温24h,取出后离心。上清呈红色（溶血）为阳性。【质量控制】注射器要干燥，小试管耍清洁，操作过程中避免溶血，防止出现假阳性。 孵育24h血块未回缩者，可用小玻棒沿管捲轻轻分离，然后离心，观察结果。【临床意义】正常人为阴性。阳性见于ph,其他溶血性贫血亦呈阳性，但阳性率比pnh 为低。木试验用于pnh的筛选。实验九、高铁血红蛋白还原试验一、比色定量法【实验原理】6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pd)在戊糖旁路中使6-磷酸葡萄糖转变为6- 磷酸葡萄糖

20、酸，同时催化氧化型辅酶ii(nadp)形成还原型辅酶ii (nadpi1),再使氧化型 谷胱甘肽(gssg)形成还原型谷胱甘肽(gsh)o nadpi1是高铁血红蛋口还原酶的辅酶，在递 氢体美兰和高铁血红蛋片还原酶的作用下，使暗褐色的高铁血红蛋白还原为红色的血红蛋 口。当红细胞内g6pd含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，具至不能还原。【试剂】1. 12.5g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液 亚硝酸钠1.25g,葡萄糖5g,加蒸镉水至100mlo 置棕色瓶内4°c下可保存1个月。2. 0. ooodmol/l美蓝溶液美蓝15mg放乳钵屮，加少量蒸僻水研磨后过滤，再加蒸係 水至100m

21、l o室温可保存12个月。3. 0. 02inol/l 磷酸盐缓冲液(ph7.4) 取 na2hp04229. 5mg, k1lpo.52. 2mg,加蒸係水 至 100mlo【操作方法】1. 静脉采血1.5-2. 0ml,加入含w 38g/l枸椽酸钠抗凝剂的小瓶内(血：抗凝剂=9:1), 再加葡萄糖20mg摇匀。2. 取血液1.0ml,加亚硝酸钠-葡萄糖溶液和美蓝溶液各0. 05ml,颠倒混合12次,使 与空气屮的氧充分接触。加塞，37±0. 5°c水浴(或孵箱)保温3h。3. 取出后摇匀,取0. lml加于10ml磷酸盐缓冲液中溶解,2min后于波长635nm处(或 红

22、色滤光板)比色，用蒸懈水作空片，测其吸光度(a)o4. 另取原血液0. lml,按上法加缓冲液溶解后比色，测其吸光度(b)。再于此液中加 亚硝酸钠-葡萄糖液1滴，摇匀，5min后比色，测其吸光度(s)«【计算】a-b高铁血红蛋白还原率%二(1) x100s-b【参考区间】高铁血红蛋口还原率75% (比色法)【质量控制】1. 红细胞比积低于30%时，高铁血红蛋白述原率显著降低，必须调整红细胞与血浆的 比例。2. 本试验抗凝剂若用acd保养液时，该保养液与血液z比为0.15:1。该抗凝血可保存 1周。因草酸盐具有述原性，不宜使用。3. 标本不应有凝块或溶血，以免影响测定结果。4. 测定吸

23、光度时，分光光度计的波长应准确。一般要求s比b大8倍以上。【临床意义】本试验川于g6pd缺乏症的过筛检查，蚕豆病和们氨咳咻型药物溶血性贫血患者，由于g6pd缺陷（隐性遗传），高铁血红蛋口还原率明显下降。杂合子型多在74%31%之间，纯合 了型常在30%以下。二、细胞化学法【实验原理】 红细胞內血红蛋白对被亚硝酸钠氧化为高铁血红蛋白，后者可经美兰还 原为血红蛋白；g6pd缺乏时则高铁血红蛋白不被述原。加入氧化物后形成置化高铁血红蛋 口，易被过氧化氢洗脱，染色后形成空影红细胞。正常的红细胞，氧合血红蛋口的过氧化酶 活性，不被置化物抑制，阻止了枸椽酸盐的洗脱作用，保证红细胞的正常形态。【试剂】1.

24、反应试剂 取0. 0004mol/l美蓝溶液lml, 12. 5g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液0. 5ml, 生理盐水& 5ml,混匀。此液于冰箱中可放置1周。2. 0. 4mol/l m化钠（或氤化钾）。3. 洗脱液 95%酒精 400ml, 0 2mol/l 枸椽酸 & 0ml, 30% h2022. 5ml,混匀。4. 固定液甲醇5. 染液5g/l苏木素液，4g/l伊红液。【操作方法】1. 取acd抗凝血0. 05ml,置于预先盛有0. 05ml反应试剂z小试管中，摇匀，放37c 水浴（或孵箱）中保存4h。2. 取出后用滴管轻轻吸去上清液，于剩f的红细胞中加入0. 4mol/

25、l氧化钠0. 005ml （细 玻棒醮起一小滴），摇匀。3. 5min jti加入1滴患者血浆（或ab型血浆），用滴管混匀，取岀1滴作薄涂片，待干。4. 将玻片放入盛有洗脱液的染色缸内，上下移动lmin,再静置于液屮24niin,取出 后甲醇固定半分钟，水冲洗，待干。5. 用苏木素染23min,水冲洗，再以伊红染1 4min水冲洗，待干。6. 在高倍镜下观察，计数1000个红细胞（涂片四角及中央各数200个），算出g6pd 缺乏红细胞（空影红细胞）的百分率。【质量控制】 本法受洗脱液ho浓度的影响，因比02易分解，不易保存所需浓度，因 此使用过程屮宜随时补充少量haozo补充的量依使川次数的多

26、少、放置时间和室温高低而定, 需凭经验掌握，最好用阴性、阳性样本对比试验來确定。【临床意义】 正常人空彩红细胞0. 4%, g6pd严重缺乏者8& 0%,杂合了 0. 4%88%。 此法对于杂合子的检出敏感性较高，但作为筛选法则过于繁琐。实验十、变性球蛋白小体检查【实验原理】 氧化物质町使g6pd缺乏患者的红细胞中积蓄多量的出0?等氧化剂，使血红蛋口氧化变性。而与某些碱性染料（如煌焦油蓝）或结品紫孵育后形成蓝黑色或紫黑色 颗粒定位于红细胞内。【试剂】 用0. 73%nacl溶液配制成1%的结晶紫（龙胆紫）溶液。【操作方法】 滴1滴试剂于载玻片上，用玻棒或竹签蘸一点患者血液于其上，混匀,

27、 加盖玻片，染5lomin后在高倍镜下观察。计算500个红细胞中含变性珠蛋白小体红细胞 的百分率。含变性珠蛋白小体的红细胞是在红细胞屮岀现多个紫黑色、或细或粗、形状不规则的颗 粒，位于细胞的边缘或中央，血红蛋白或仍均匀分布，或完全缺如。【参考区间】 正常人无变性珠蛋片小体，或偶见几个（0.01）细小者。【临床意义】 阳性见于g6pd缺乏症患者（3%82%）,随着溶血的恢复逐渐减少或消 失。还见于不稳定血红蛋口病，呈单一的圆形或卵圆形粗大颗粒，附着于红细胞膜或突出于 其外。另外，硝基苯、苯胺、苯脐等化学物质屮毒者也可出现变性珠蛋白小体。实验计葡萄糖6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验【实验原理】 在葡萄糖

28、-6-磷酸（g6p）和nadp存在下，g6pd能使nadp还原成nadph, 麻者在紫外线照射下可发出荧光。【试剂】混合剂的成分与配方如f：0.lmol/l g6plml7. 5mmol/l nadplml0. 7mol/l tris-hcl（pi17. 8） 3ml8mmol/l氧化型谷胱u fla lmllog/l 皂素 2ml蒸餾水加1此混合试剂分装，置-20°c保存，可稳定数月。【操作方法】1. 取末梢血或抗凝血5lou 1,加入含100卩1反应试剂的小试管屮。亦可取血滴于 滤纸上，干后取直径约为lcm的血迹剪碎，置含反应试剂的小试管中洗脱。2. 放 37°c 孵育

29、 lomino3. 取约10卩1溶血液滴于新华滤纸上，晾干后立即用冷风吹干，在长波紫外线卜-观察 结果。【结果观察】g6pd正常者可见明亮荧光，严重缺乏者无荧光，杂合了介于两者之间 （弱荧光）。【质量控制】1. 本法是直接测定nadph的量，特界性较好。2. 每次或每批要有(g6pd) 1e常和缺陷者的标本作对照。3. 取血量以510u 1为宜，正常者宜偏少，贫血者可偏多。4. t血滤纸片存在其酶活性可损失，宜同吋作正常对照血样站。5. 加入gssg是为了提高敏感性，因冇残余g6pd活性的标本(如杂合了)，可产生少量 nadph,若有足量的gssg存在，则通过谷胱甘肽还原酶的作用，再将其氧化为

30、nadp。这样 患者和正常红细胞即可显示明显差别。不使用gssg亦可，效果稍差，可将g6p-na2和nadp 浓度减半，血样本用生理盐水稀释至1/4,孵育时间缩至3min,对减弱残余酚活性的彫响。【临床意义】 正常人有很强的荧光。g6pd缺乏者荧光很弱或无荧光；杂合子型或某 些g6pd变界体者可有轻度或中度荧光，本试验适用于大批量筛选，但不利于杂合子型的检 出。实验十二、硝基四氮哇蓝试验硝基四氮哇蓝试验(nitroblue-tetrazol iumtest)有定性试验和g6pd活性定量测定两 种。一、定性纸片法【实验原理】nadpii通过吩嗪二甲酯硫酸盐(m-pms)的递氢作用，使淡黄色的硝基

31、 四氮哇蓝(nbt),还原成紫色的甲。g6pd缺乏时由于nadpi1牛成不足，不显紫色。【试剂】1. 0. 25mol/l tris-ilcl缓冲液(ph74) 称取三疑甲基氨基甲烷(tris) 7. 6g,溶 于蒸馆水约100ml中,先加入lmol/hcl 60ml,然后用ph计调整ph至74,再加蒸憾水200ml ° 在4°c可保存数月。2. 0. 6g/l m-pms m-pms 6mg 加蒸係水 10ml 溶解，加入 0. 01mol/l iic11 小滴调整 ph 至3. 8左右。于棕色瓶内，暗处存放，可保存2周以上。如试剂由黄变绿，应重新配制。3. 3g/l n

32、bt nbt 15mg加蒸憾水5ml,在水浴中加热至80°c左右溶解,过滤。用棕色瓶 盛装，可保存2周以上。4. 6. 25mmol/l g6p-na2 称取 g6p-na210mg,用 tris-hcl 缓冲液 4ml 溶解。放 0°c 可保 存1个月以上。5. 6. 25mmol/l nadp 称取 nadp 10mg(如用含 70%的制品则称 14mg),加 tris-hcl 缓冲 液2nd溶解。放0°c可保存数月。6. 0. 12mol/l mgcl2 称取分析纯 mgcl2 - 6h20 2. 10g 溶于蒸镭水至 100ml。为 g6pd 的激活剂。7

33、. 反应试剂 m-pms 0. lml, nbt 0. 5ml, g6p-na2 0. 4ml, nadp 0. 1ml, mgcl2 0. lml,混合，当天配制。8. 对照试剂 用等量tris-hcl代替g6p-na2和nadp,余同反应试剂。【操作方法】1. 取末梢血1滴，滴于干净滤纸上，血迹直径1.0cm左右，自然晾干（密封后4"c保存,酶活性可维持57天）2. 用打孔机打出一小圆血迹红片（直径约5mm）,迸于反应板的小孔内，加入蒸係水1滴摇匀，静置5min,待红细胞完全溶解。3. 用6号半至7号注射针头吸取反应试剂，在每个放置血纸片的小孔屮央加入1滴,轻轻混匀。加盖，置37

34、°c水浴箱屮温育1030mino以对照试剂取代反应试剂作对照。【结果观察】 正常'酶活性者纸片变为紫蓝色；酶严重缺乏者仍为红色；杂合子为淡紫红色。观察时与对照孔比较看颜色的区另i。【质量控制】1. 血迹纸片放置时间长短对结果观察为重要。如为新鲜血纸片，37°c 5lomin能看到结果，若放置数小时，则2030min才现结果，故应在同一批标本相互比较。2. 缓冲液的ph要准确。3. 遇到他缺乏或町疑标本，应用定量法来确证。二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性定量测定【实验原理】 与定性纸片法相同。nadp11生成的量与甲 牛成的量在一定范围内呈线性关系，在分光光计波长650

35、mn测定甲 的吸光度，可反映nadpii牛成的量，用以代表g6pd 活性。【试剂】1. 反应试剂 对照试剂及其各种组成液均与定性纸片法相同。2. 7mol/l尿素称取分析纯尿素210g,溶于蒸馆水至500ml （可微热溶解），室温保 存。3. 鼠化鬲铁血红蛋白测定法试剂(dmbkin) nahc03l. og, k3fe(cn)60. 2g, kcno. 05g,加蒸馆水至1000ml,置棕色瓶内暗处保存。【操作方法】1. 取抗凝血（肝素或edta血需在12h内测定,acd血在04°c可保存至3天）0. lml,用生理盐水洗涤红细胞3次（2000r/min）,吸去上清液及白色层（为血

36、小板及白细胞，如不 吸去则结果增高）。2. 红细胞悬液内加入蒸镭水34ml,（般视其颜色深浅而定），使其溶血，混匀，静置 1omino3. 取0.4ml溶血液，加入4. 0ml drabkin试剂,放置15min,用drabkin试剂作空白,光径lcm,于540nm波长读取吸光度（ii）。4. 另取2只试管,每管准确加入溶血液0. lml于管底。5. 于第一管中加对照试剂0. lml,摇匀，放入37+0. 5°c水浴中保温，并立即用秒表记 录时间。于第二管中加入反应试剂0. lml,摇匀,待秒表行至30s时,放入水浴中保温。6. 准确30miri取出第一管，立即加入7mol/l尿素2

37、5ml,以终止反应。30s钟后取出 第二管加入尿素2. 5mlo7. 用分光光度计比色，光径lcm,波长650nm,以第一管为空口，测定第二管吸光度(s)。 【计算】 以每克hb每分钟吸光度变化值作为单位，即nbt单位(u)=aa/min/hb(g)。0. lml溶血液中含hb (g)644584.411=0. 1xhxxxx440.4 1000 1000=hx0. 00161s1 sg6pd(u)hx=x20.7hxo. 0016130 h【参考区间】：6. 720. 5u中间缺乏值(杂合子)：1.76. 6uo严重缺乏值：低于1.6uo【质量控制】1. 试剂配制必须严格按照操作规程。反应试

38、剂配制后放置24h,显色反应明显降低。2. 标本如不能及时测定，应保存于冰箱(04°c)o洗涤后的红细胞，特别是溶血液不 能久置(4°c不能超过4h)。3. 缓冲液的ph,保温温度、时间及加入溶血液量都必须十分准确。4. 尿素的作用是终止酶促反应，并保持色泽澄明度。加尿素后应尽快比色(不超过lh)o5. 由于甲 溶解度低，溶血浓度不宜过高，一般以吸光度0.3000.400为宜。6. 由于使用的nbt不同，各实验室最好建立口己的参考值。7. hb测定必须准确，应用hicn标准液校正所有仪器，测得的h值应先乘以校正系数 然后带入计算公式。实验十三、丙酮酸激酶(pk)荧光斑点试验

39、【实验原理】由pk产生的丙酮酸作用于ldh,使其转变为乳酸，同时nadh转变为nad 在长波紫外线照射k nadh有荧光，nad'无荧光，故反应后荧光逐渐消失。【试剂】1. 0. 15mol/l pep 249mgpep 溶于蒸馆水 5ml 中,0. 2mol/l naoh 调整 ph 至 78。2. 0. 03mol/ladp adp 二钠盐 150mg 溶于蒸tg水 5ml 中，用 0. 2mol/l naoh 调整 ph78o3. 0. 08mol/l mgso> mgsoi 7h20 98mg 溶于蒸镭水 5ml 中。4. 0. 25mol/l 磷酸盐缓冲液(ph7.4)

40、取 kh2po4 3. 40g, k2hpo1 4. 35g,分别配成 100mlo 然后取kh2po1溶液19. 2ml, k2hpo4溶液80. 8m 1混合，校准ph74。5. 反应试剂pep 30u 1, adp 100u 1, mgsoi 100m 1,磷酸盐缓冲液50 n 1,蒸谓水 720 u 1,混合。在4°c保存1周,临用时加nadh干粉ling,混匀。【操作方法】1. 取抗凝血（肝素、edta或acd）经1000r/min离心沉淀5min,将血浆及白细胞小心 吸弃。2. 川冷生理盐水洗红细胞3次，授后川冷生理盐水配成20%红细胞悬液。3. 于小试悖中加200 u

41、1反应试剂，再加红细胞悬液20ul,混匀，置37°c水浴中反 应。4. 在反应开始、10、20、25、30和60min各取此液，点在新华滤纸上，晾至完全干燥, 在长波紫外线下观察荧光点。【结果观察】pk活性止常者荧光在20min消失，中间缺乏者（杂合了）荧光在25 60min消失，严重缺乏者（纯合子）荧光60min不消失。【质量控制】1. 每次试验都应川正常人血液作阴性对照。2. 白细胞和血小板屮含有与红细胞屮类型不同而活性很高的pk同工酶，而且在pk缺 乏症其活性也不降低，故血液离心后应尽量除去白细胞和血小板。3. 本法不川皂素而用低渗反应试剂來破坏红细胞，这样可使由残存白细胞和血

42、小板中 释放出的酶量很少，不影响试验的可靠性。【临床意义】 正常人木试验为阴性，即荧光逐渐消失。内酮酸激酶缺乏症患者呈阳性 （荧光不消失），可川于丙酮酸激酶缺乏症的过筛试验。实验十四、丙酮酸激酶活力测定【实验原理】在adp存在下，丙酮酸激酶（pk）使磷酸烯醇式丙酮酸（pep）转变为丙恫酸，后者通 过乳酸脱氢酶（ld11）作用转变为乳酸，同时mdi1转变为nad nadii在340mn处有吸收峰, 故可根据吸光度的改变來推算pk的活力。【试剂】1. 0. 3mol/l tris-hcl 缓冲液（pi17.4）:取 tris 3. 63g, kc1 1. 679g, mgso, *71120 0.

43、 592g 溶于90ml蒸馅水中，用0. lmol/l hc1调节至ph7. 4,加水至100ml,每管5ml分装,于-20 °c保存。2. adp溶液:取adp二钠盐6. 5mg,溶于lml蒸帽水中,宜少量配制，置4°c备用。3. 5mmol/l nadu溶液：取nadh 3. 5mg溶于lml蒸係水屮，宜少量配制，1°c备用。4. ldh溶液：口兔肌肉提取z悬液，活力单位为600u/mle5. 30mmol/l pep溶液:称取磷酸烯醇式丙酮酸钱盐14. 43mg,溶于lml蒸憎水中,用 前宜少量配制,置4°c备用。【操作方法】1. 取肝素或edta

44、抗凝血3. 5ml,加lml 60g/l右旋糖肝,室温（20°c）静置30min后 吸弃上层含有白细胞的血浆。2再加linl右旋糖酹,并用生理盐水补足4. 5ml,重复6次,然后把几乎无白细胞的 红细胞用生理盐水洗2次。3. 取洗过的红细胞经压积为80%90%的悬液,吸0. 1ml,加入4ml蒸憾水中,使其溶 血。溶血液登冰浴屮备用。4在10mm光径的比色杯中依次加入tris缓冲液1. 00ml,h2o 1.48ml,nadh溶液0. 10ml, adp 溶液 0. 10ml, ldh 溶液 0. 02ml, pep 溶液 0. 20ml,总容量 2. 90ml, 37°保

45、温。5. 分光光度计340nm, 37°c在测定管加入0. lml溶血液后，立即计时,用蒸憾水调零, 每分钟测吸光度1次,共测15mino6. 根据读数记录，在线性反应期算岀平均吸光度下降值aj/min,再按下式计算。【计算】pk活性（u/ml红细胞）a/j/rni n4. 13.01=xxx 6.220. 10. 1pcv（6. 22=nadh的亳摩尔吸光系数）【参考区间】1.22. 2u/ml 红细胞（37°c）【质量控制】1. 血液标本需新鲜，若以4”c贮存血进行测定，则须有同样贮存血的止常对照。2. 血细胞含有相当高pk活性，即使在红细胞pk缺乏症亦是如此。故必须尽

46、可能从红 细胞悬液中除去。【临床意义】红细胞丙酮酸激酶缺乏症为常见的先天性非球形细胞溶血性贫血，属常 染色体隐性遗传。纯合了时，pk活性显著降低；杂合了时，无贫血症状，但酶活性降低， 介于正常人和纯合子之间。实验十五、自身溶血试验及纠正试验【实验原理】 将肝索抗凝血® 37°c孵育48h,观察自然溶血程度，并结合加葡萄糖及 atp纠正试验，协助遗传性球形红细胞增多症的诊断，并鉴定其类型。【试剂】1. 10%葡萄糖（无菌）。2. 等渗盐水（无菌）。3. 0. 4mol/l atp ±理盐水无菌液。4. 0. 4g/l氨水（浓氨水0. 16ml加水至100ml）或hi

47、cn转化液。【操作方法】1. 取小试管4支,分别加lg/l肝素0. 02ml, 3. 624kg （8磅）15mir）高压灭菌,烘干。2. 取静脉血4nil,以无菌手续按表15-1加入各管，混合抗凝，然后依次操作。3. 以冷藏血离心示的血浆0.2ml加0. 4g/l氨水或转化液4. 8ml为空白对照管，在540nm 处测各管吸光度a值。4. 计算各管溶血率（相当于空白对照管100%的比值）。测定管ax （1 -红细胞压积）测定管溶血率二溶血对照管ax4【质量控制】操作过程严格无菌。【临床意义】正常人血液无菌时孵冇48hfi溶血率很低，一般4.0%。加葡萄糖或atp 后，溶血率更低（0.6%）,

48、而各类溶血性贫血溶血率不同程度增强。遗传性球形红细胞增多 症口身溶血早而明显，能被葡萄糖纠正。遗传性非球形红细胞溶血性贫血，口身溶血增加， 其中1型因6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性降低，能被葡萄糖和atp纠正；ii型表15-1自身溶血试验操作表123溶血对照肝素抗凝血（ml）1.0 1.0 1.(1.010%葡萄糖（ml）0.05一0. 4mol/l atp(ml)一0.05一9g/l nacl(ml) 0.(537°c孵冇48小时测红细胞压积4°c冷藏孵育血浆（ml）0.20.20.2全血0. 10. 4g/l氨水或ilicn转化液(mi)4.84.84.89.9系丙酮酸激陆缺

49、乏，溶血不能被衙萄糖纠正，但能被atp纠正。pnh、自身免疫性溶血性贫 血、药物性溶血等均不能被衙萄糖纠正。大部分不稳定血红蛋口病例自身溶血率轻度增加, 加葡萄糖1型可以纠正，ii型则不能纠正。实验十六、血红蛋白电泳【实验原理】利用各种血红蛋白（包括正常或界常hb）珠蛋白及等电点不同，在一定 电场和ph缓冲液中电泳方向和速度亦不和同，hb与等电点缓冲液的ph差别越大，hb电泳 速度越快；相反则电泳速度越慢。采用不同的缓冲液，支持介质和电泳仪具分辨率不同。以 此來判断界常hb的性质，为诊断界常hb病提供依据。在电泳中，因所用支持物不同，而冇纸上电泳、琼脂电泳、淀粉胶电泳、醋酸纤维素薄 膜电泳等。

50、电泳胶分辨率较高，但制板较费时不方便，琼脂凝胶电泳应用于某些异常hb 的分辨。醋酸纤维素膜电泳方法简便，省时，易于洗脱定量，对异常hb分辨率较好，适于 般试验宗作为界常hb的筛选试验。在缓冲液选择上，多以碱性（ph8.5或9.1）缓冲液浸 泡薄膜，用硼酸盐缓冲液进行电泳筛选。必要时再用ph66. 2缓冲液电泳鉴别。【试剂】1. 0. 26mol/ltris缓冲液（ph9. 1）（用于阳极） 三魁甲基氨基甲烷25. 2g, edta2. 5g 或 edta-na22. 83g,硼酸 1. 9g,加蒸馆水至 1000ml o2. 巴比妥缓冲液（p118.6）（阴极）巴比妥钠515g,巴比妥0. 9

51、2g,加蒸镭水至1000mlo3. 醋酸纤维索薄膜浸泡液、两种缓冲液等量混合。4氨基黑10b染色液氨基黑10b lg,磺基水杨酸10g,冰醋酸20ml,加蒸懈水至400mlo5. 漂洗液 乙醇45ml,冰醋酸5inl,蒸饰水50ml混合。6. 透明液 冰醋酸25ml,无水乙醇75mlo7. 0. 4mol/l naoho【hb液的制备】 将抗凝血离心去血浆，加生理盐水洗涤3次。每ml红细胞加1.4ml 蒸镭水和0.4ml四氯化碳，强烈振摇5min,离心后取上清液于4°c冰箱保存备用（不适用于 不稳定血红蛋白检杏）。【操作方法】1. 电泳槽内阳极注入p119. 1的tris缓冲液；阴极

52、注入pii8. 6的巴比妥缓冲液，要求两 极液而平行。2. 醋酸纤维索薄膜切成12x4cm的条状，迸于浸泡液内lomin后取出，用滤纸吸去多 余液体，使粗而朝上，贴于电泳槽的支架上，用两层纱布搭桥，口然平衡5mino3. 用hb吸管吸取23ul 10%hb液，放在盖玻片上（长约lcm）边缘,使z印在靠阴 极端1.5cm薄膜片处，薄膜下衬一张干燥滤纸以吸去多余的lib液，同时川正常人血红蛋白 液做对照。4. 接通电源，平衡5min后，调电压至150v,电流0. 2nia/chi薄膜宽，电泳1530min。 取卜薄膜条，登于氨基黑10b染液'i', lomin后取出，川漂洗液至薄膜

53、条洁白为止。5. 定量测定 将各小区带剪fjlbai用20ml 0. 4mol/l naoh脱色,hb/l用4ml 0. 4mol/l naoh脱色。另取一条无色膜条（与冊短带相仿大小）,加0. 4mol/l naoh液4ml作为空白, 用分光光度计,在640nm处比色,记录吸光度,按下式求其含量（%）。hba2吸光度llba2（%） = x100hba2吸光度+hba】吸光度x5【质量控制】1. 醋酸纤维索薄膜应在浸膜液屮浸透。2. 防止被检血红蛋白以外的标木污染薄膜。3. 为保证电泳效果，电泳槽内缓冲液最多使用两次。【参考区间】1. 1%3.2%。【临床意义】hba2增高是轻型地中海贫血的

54、重要特征。此外，巨幼红细胞性贫血，恶性贫血，某些不 稳定血红蛋白等，hba?也相对增鬲。在电泳分组中，以hba为标志，较hb/快者包括h组和 j组,属快速异常hbilba?减低见于缺铁性贫血及铁粒幼红细胞性贫血等。实验十七、抗碱血红蛋白（hbf）测定【实验原理】 抗碱血红蛋白具有抗碱变性的能力，在碱性溶液屮不易变性沉淀，其他 lib在碱性溶液屮町变性而被沉淀剂沉淀，测具滤液屮hb含量即hbf的含量。【试剂】1. 0. 083mol/l koh 4°c保存，用前应滴定校正。若有沉淀或混浊应弃去。2. 半饱和硫酸钱 取饱和硫酸钱（约390g/500ml） 4ml,加蒸饰水4ml及lmol

55、/l盐酸0. 2mlo【操作方法】1. hb液的制备 取抗凝血1加1,川等渗盐水离心沉淀，洗涤红细胞23次。然后 向洗涤的红细胞中加入蒸饰水和四氯化碳（或氯仿、甲苯），其比例是1：15：0.5,用力 振荡56min,离心20min, jt层透明液即为hb液（约100g/l）o2. 取大试管1支,加0. 083mol/l k0i1 3. 2ml, lib液0.2ml。立即混匀，准确碱化lmin, 立即加入半饱和硫酸6. 8ml,混匀后优质滤纸过滤，其滤液为甲液。3. 另取试管1支，加蒸镭水4ml ,hb液0.02ml,混匀后为乙液。4. 以蒸係水作空白，在500nm处，测甲、乙液的吸光度（a）值

56、。5. 计算卬液a值51抗碱血红蛋白（%） =x x100乙液a值201式中51和201分别为甲、乙lib液的稀释倍数。【质量控制】1. koh浓度必须准确，ph应12,校正后最好小瓶密封，使用量及作用时间必须十分准 确。2. 半饱和硫酸镀必须准确配制，其ph应为3.0,最好小批量分装。3. 试验所用试管、吸管、仪器均不能污染酸碱，4. 过滤纸应为优质，型号必须稳定，滤液应清晰透明，否则应重新过滤或离心沉淀。5. 滤液呈淡黄色或淡红色，可使结果偏高。与所用试剂质量、浓度不足有关。6. 每次最好做重复试验。【参考区间】成人1.0%3.1%。新牛儿55%85%, 24个月后逐渐卜降，1岁左右接近成人水平。【临床意义】b-地中海贫血hbf明显升高，重者可达30%90%。口血病、淋巴瘤、再 障、pnh、真性红细胞增多症等也轻度升高。hbf升简还应结合hb电泳图谱，以判定是hbf 升高,还是hb bart升高。实验十八