老脑痴呆动物模型

1、一种新的老年痴呆动物模型组员： *摘要 建立一种新的老年痴呆 (AD) 小鼠模型 ,AD 及其治疗药物的研究。选用 NIH 小鼠 , 腹腔注射 D2 半乳糖 120mg/kg 和亚硝酸钠 90mg/kg, 每天 1 次, 连续 60d, 制备老年痴呆动物模型。通过水迷宫试验 , 脑组织匀浆蛋白质含量、乙酰胆碱酯酶 (AchE) 和超氧化物歧化酶 (SOD)活性的测定 , 脑组织病理切片 HE染色和刚果红染色 , 比较老年痴呆模型小鼠和正常小鼠的差异。与对照组比 , 模型组小鼠的逃避潜伏期明显增加 (P<0101), 脑内蛋白质含量没有明显差异 , 脑内 AchE活性增加 (P<01

2、01),SOD 活性下降 (P<0101); 模型组小鼠出现触须脱落 , 大脑皮层出现类老年斑病理改变 , 海马和大脑皮层神经元变性坏死。 D2半乳糖和亚硝酸钠合并制备的老年痴呆模型在一定程度上模拟了AD的发病特点 , 可作为 AD及其治疗药物研究的一种新模型。关键词 阿尔茨海默病 ; 学习记忆 ; 超氧化物歧化酶 ; 老年斑老年痴呆 (AD)缺乏有效治疗手段的原因之一在于与人类AD 相似的动物模型未能真正建立起来 , 现有的 AD模型大多只针对 AD病理的某一方面 , 只能模拟 AD诸多病理变化中的一个侧面 , 相对 AD 的多因素发病和错综复杂的病理过程来说均有较大的差距。因此 ,

3、建立能够在行为以及组织病理方面较好地模拟AD 的动物模型是 AD研究的热点之一 , 将有助于推动 AD发病机制的研究和治疗药物的筛选。已有许多文献报道 , 小鼠、大鼠皮下注射或腹腔注射D2 半乳糖可造成亚急性衰老模型 , 注射亚硝酸钠则可造成全身多脏器的缺血缺氧, 导致学习记忆成绩下降 , 我们将二者结合起来 , 用 D2 半乳糖使青年小鼠在较短的时间内呈现出自然衰老小鼠的特征 ; 用亚硝酸钠造成脑缺血缺氧 , 影响其学习记忆能力 ; 通过行为学试验、脑内相关指标的测定、脑组织病理检查等方法来研究这种模型与人类AD的相似程度 .1 材料和方法1.1 实验动物和主要试剂 NIH 小鼠购自第一军医

4、大学实 验动物中心 , 合格证号: 粤检证字第 2000A037 号。蛋白定量 ( 双缩脲法) 测定试剂盒( 批号20010801)、乙酰胆碱酯酶 (AchE) 活性测定试剂盒 ( 批号 20011105) 和超氧化物歧化酶 (SOD)活性测定试剂盒 ( 批号 20011109), 均购自南京建成生物工程研究所。 D2 半乳糖 ( 生化试剂 ) 上海试剂二厂产品 , 批号 991215。亚硝酸钠 ( 分析纯 ), 汕头市光华化学厂产品 , 批号 20001020。1.2 小鼠 AD模型的建立 雌性 NIH 小鼠 40 只,20 24g, 每组 20 只 , 随机分为空白对照组和 AD 模型组。

5、造模方法为 : 小鼠每日腹腔注射 D2 半乳糖 120mg/kg 和亚硝酸钠 90mg/kg, 连续 60d; 空白对照组腹腔注射等体积生理盐水。1.3 水迷宫试验 自动记录水迷宫装置为 80cm×50cm×20cm 的茶色有机玻璃槽 ( 中国医科院药物所研制 ), 内设起点、终点 ( 台阶 ) 和多处盲端 , 水深 9cm,水温24 27 , 记录小鼠从起始点放入至找到台阶的时间( 寻找潜伏期 ), 若超过120s 则以 120s 计。给药完毕后第1 天, 各组小鼠进行训练 , 使其找到台阶 ; 第24 天加长路程 , 记录各组小鼠的寻找潜伏期。1.4 脑内相关指标的测定

6、 行为学试验结束后 , 每组取 10 只 小鼠禁食 12h, 断头处死 , 取全脑 ( 嗅脑除外 ), 置玻璃匀浆器 中, 加入预冷生理盐水制成 10%(g/ml)脑匀浆 ,3000r / min 离心 10min, 取上清液置冰浴中 , 测定蛋白含量和活性 , 按试剂盒说明书所述步骤操作 , 取样量均为 50 l 。AchE、 SOD1.5 病理检查 各组余下小鼠腹腔注射戊巴比妥钠 60mg/ kg 麻醉 , 仰卧固定于手术台上 , 剪开胸腔 , 暴露心脏 , 用生理盐水和 4%多聚甲醛进行心脏灌注固定 , 至四肢僵直为止 , 取全脑和颊部皮肤组织置 4%多聚甲醛溶液中固定 24h, 石蜡包

7、埋切片 , 常规 HE染色和刚果红染色。1.6 统计方法 数据以平均值±标准差表示 , 使用 SPSS810统计软件处理 , 用 t 检验进行统计学分析。2 结 果2.1 水迷宫实验结果 见表 1。可见模型组小鼠的寻找潜伏期始终明显长于对照组 , 表明模型组小鼠的学习记忆能力下降。表 1 小鼠水迷宫逃避潜伏期测定结果 (s,x ±s)组别n第 2 天第 3 天第 4 天空白对照组1875.4±29.851.8±27.034.6± 12.6模型组17100.4±31.591.9±40.273.4± 27.1与空白对照

8、组比 :1)P<0105,2)P<0101;2.2 小鼠脑内生化指标测定结果 两组间的蛋白质含量没有 显著差别 , 模型组AchE活性比空白对照组明显升高 , 模型组 SOD活性比空白对照组明显降低。表 2 小鼠脑内蛋白含量、 AchE活性、 SOD活性的 测定结果 (x ±s)组别蛋白含量 (mg/ml) AchE活性 ( mol/mg) SOD 活性 (nU/mg)空白对照组3.330.735± 0.05423.3±2.5模型组3.190.29±0.07615.9±1.42.3 病理检查结果 脑组织切片显示 , 对照组海马和皮层

9、神 经细胞染色均一、结构完整 , 细胞膜、核膜清晰。模型组海马可见明显散在的或连续的神经细胞变性坏死 , 表现为胞浆深染、核固缩、胞膜核膜界限不清晰 ; 严重的出现点状中断 , 在大脑皮层也可见较多变性坏死的神经细胞 , 偶尔可见类老年斑结构 , 这些可能是其行为上出现障碍的病理基础。实验过程中 , 模型组小鼠在约 40d 时出现普遍的触须脱落 。颊部皮肤组织切片显示 , 对照组小鼠触须的毛囊饱满、圆整 , 内部结构层次丰富 , 被毛排列致密整齐 ; 而模型组的毛囊则出现萎缩、塌陷 , 由于触须的脱落 , 毛囊内出现明显的空洞 , 被毛排列稀疏、不规则。3 讨 论D2 半乳糖造成动物的老化效应

10、早有报道, 青年小鼠长期注射D2 半乳糖后 , 由于其代谢产物半乳糖醇不能被进一步代谢而堆积在细胞内 , 影响渗透压 , 导致细胞肿胀 , 代谢紊乱 , 体内活性氧水平升高 , 细胞膜脂质受损 , 以致产生机体多器官、多系统的功能衰退 , 这些变化均与老龄小鼠相似。 D2 半乳糖还会引起脑神经元的一系列退行性变化 , 包括神经元数目减少 , 脑组织中 SOD活性下降 ,MDA脂褐素水平升高 , 表现为学习记忆能力下降。因此我们给青年小鼠腹腔注射 D2 半乳糖 60d, 造成亚急性衰老模型来模拟 AD发生于老年人的特点。目前常采用 1 次腹腔注射亚硝酸钠120mg/kg 造成小鼠的记忆巩固障碍模

11、型, 亚硝酸盐大量进入机体后 , 可使正常的血红蛋白变为高铁血红蛋白 , 失去携带氧的功能 , 引起组织缺氧 , 导致大脑意识和行为上出现障碍。我们对此做了适当的改进 , 将剂量调整至死亡率较低的 90mg/kg, 并连续腹腔注射 60d, 通过较长时期的反复脑缺氧 , 造成动物学习记忆能力的 明显下降。行为学试验结果显示 , 随着训练次数的增加、训练时间的推移 , 空白对照组小鼠的寻找潜伏期迅速缩短 , 表明正常小鼠很快熟悉水迷宫环境并找到终点 , 而模型组小鼠的寻找潜伏期居高不下 , 表明模型组小鼠的学习记忆功能受损。Ach 是中枢胆碱能神经系统重要的神经递质, 它由胆碱乙酰化转移酶 (C

12、hAT)催化合成 , 乙酰胆碱酯酶 (AchE) 催化分解。迄今为止 , 多数研究表明AD患者脑内ChAT和 AchE 活性降低 ,Ach 含量不足 , 导致中枢神经系统功能障碍, 学习记忆能力下降。但有关 AD 动物模型脑内 AchE 活性变化的报道却不尽一致, 有的降低 ,有的升高 , 主要是因为不同的作者采用的 AD 动物模型有很大差别 , 有的采用 D2 半乳糖和 AB 合并造模 , 有的仅用东莨菪碱一次腹腔注射造成动物学习记忆障碍。此外 ,AchE 活性测定方法的不同对结果可能也有一定影响。我们的研究结果显示 ,AD 模型组小鼠脑内 AchE 活性增高 (P<0101) 。由于

13、 AchE 活性的异常增高 , 造成脑内神经递质 Ach 被大量水解 , 含量下降 , 导致中枢神经系统功能障碍 , 出现学习记忆和认知能力下降。研究表明 ,AD 患者脑组织中总 SOD、 Mn2SOD和Cu/Zn2SOD活性均明显低于正常脑组织 , 血清和脑脊液 SOD水平也比对照组低 , 而脂质过氧化物 (LPO) 水平则明显升高 , 这提示 AD 的发生发展与自由基有密切的关系。体内过多的氧自由基能攻击损害神经细胞膜 , 干扰细胞内酶系统的正常功能 , 造成神经细胞老化和变性 , 最终导致 AD发生。我们的实验结果与上述报道相近 , 模型组小鼠脑内 SOD活性明显降低 (P<010

14、1), 因此其清除氧自由基的能力下降 , 神经元受损 , 从而造成小鼠的认知功能减退。脑组织病理检查显示模型组小鼠大脑皮层和海马均出现变性坏死的神经细胞, 皮层偶尔可见类老年斑结构 ,这与 AD 患者脑内出现的病理变化类似。由于中枢神经细胞一般是不可再生的 , 因此这种病理变化必然影响到脑内信息的传递和处理 , 从而使动物在行为、认知和学习记忆上出现障碍。此外 , 在实验过程中出现了罕见的触须脱落现象 , 触须是小鼠特化的硬毛 , 是大脑的感觉器官 , 对于动物确定方位起着特别重要的作用。在结构上表现为毛囊周围的神经与血管比一般的被毛丰富。因此 , 造模小鼠腹腔注射促使衰老的 D2 半乳糖和导

15、致缺血缺氧的亚硝酸钠后出现触须的缺失 , 这提示动物脑内可能出现了某些变化 , 这种效应是由 D2半乳糖引起的 , 还是由亚硝酸钠引起的 , 或是二者共同作用造成的 , 其机制有待进一步探讨。综上所述 ,D2 半乳糖和亚硝酸钠合并制备的 AD模型呈现了整体衰老、学习记忆能力减退、脑内 AchE 活性增加、 SOD活性下降、皮层和海马神经元变性坏死、类老年斑形成等特性 , 在一定程度上模拟了 AD 的发病特点。鉴于 AD 发病的多因性 , 我们提出运用各种合理的干扰因素 , 从整体老化、中枢胆碱能神经系统受损、脑内 A和NFT形成等各个方面来最大程度地模拟人类 AD,现有的工作便是朝这一目标进行

16、的初步探索。4 参考文献1 尹兆宝,王健,周如倩,等的影响 J 1 中国老年学杂志1 补肾方对老年性痴呆大鼠学习记忆和,2000;20(1):332341细胞因子2 张均田 1 现代药理实验方法 ( 上册 ) M 1 北京 : 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 ,1998:10292103113 龚国清, 徐黻本 1 小鼠衰老模型的研究J 1 中国药科大学学报 ,1991;22(2):101210314 秦海强 , 李 亚, 田苏平 12 淀粉样蛋白及 D2 半乳糖对大鼠学习记 忆和胆碱酯酶活性的影响 J 1 南京医科大学学报 ,2000;20(3):195219715 田金洲 , 杨承

17、芝 , 杨惠民 1 复方大黄制剂对老龄小鼠大脑皮质和海马 ChAT、AchE活性及 Ach 含量的影响 J 1 中国老年学杂志 ,1999;19(1):3223316 赵伟, 徐宏平1 老年性痴呆患者血清和脑脊液SOD及 LPO含量 测定 J 1 河南医科大学学报 ,1998;33(2):632641 出师表两汉：诸葛亮先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。若有作奸犯科及为忠

18、善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰 “能 ”，是以众议举宠为督：愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。先帝在时，每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也。臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中