双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展

1、双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作 用研究中的应用进展双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的 应用进展 【摘要】 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation , BiFC)是指两个不发光的荧光蛋白互补片 段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧 光复合物，恢复荧光特性。基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的 蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、 面临的问题及应用前景进行了概述。【关键词】双分子荧光互补(BiFC);互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用 Abs

2、tractBimolecular fluorescence complementation BiFC means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study inte

3、ractions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC , the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described. Key wordsBimolecular fluorescence complementationBiFC ;Complementary fragments ; Fluoresc

4、ent complex ; Protein-protein interactions 1弓I言 蛋白质相互作用和翻译 后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的 进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，由现了许多 具有不同原理和应用特点的相关技术和方法：1-2BiFC作为一种用于研究蛋白质间相互作用的新型方法引起了人们的关注。利用BiFC分析能够在活细胞生理环境中原位显示蛋白质 相互作用产物，尤其是能在单细胞中同时显示多个蛋白质问 的相互作用。近年来，基于BiFC原理的分析方法在蛋白质相互作用和 翻译后修饰的研究中逐渐显现由其独特的应用价值。2 BiFC概述2.1 BiFC原理 GF

5、P及其突变体作为能够 在活体中表达且易于检测的报告基因： 3,通常是以完整的 氨基酸序列作为标记物。随着对其结构和功能研究的日益深入，不断发掘一些新 的特点，如GFP基酸序列中的莫些特定位点与氨基末端以及 竣基末端之间的序列循环互换后仍然能够正确折叠形成生 色团结构并保持荧光特性：4-5 oHu CD等通过进一步研究发现：6,在GFP及其突变体 氨基酸序列的155或173位点，将其分裂为均不具备发光性 能的荧光蛋白片段，即氨基末端片段（含 1-154或1-172氨 基酸序列）和竣基末端片段（含 155-238或173-238氨基酸 序列），当莫些特定的氨基末端片段与竣基末端片段组合作 为标记分

6、子分别与两个能够发生相互作用的蛋白质配偶体 形成融合蛋白、并同时在活细胞中表达时，蛋白质配偶体的 结合驱使氨基末端片段与竣基末端片段重新组装形成荧光 复合物，恢复荧光效应：6-7。这一现象称为双分子荧光互补（bimolecular fluorescencecomplementation , BiFC ）,能产生BiFC效应的氨基末端片段 与竣基末端片段称为互补片段。2.2 BiFC的特性2.2.1荧光蛋白片段的互补特性按照不同的分裂位点，每个荧光蛋白可产生两个氨基末端片段和两个竣基末端片段，分别以N155、N173和C155、C173表7K 0BiFC可发生于同一荧光蛋白的氨基末端片段与竣基末

7、端 片段之间，如 EYFP的N155和C155、N173和C173,也能 发生于不同荧光蛋白的氨基末端片段与竣基末端片段之间，如 GFP 的 N173 和 EYFP 的 C173、 EYFP 的 N173 和 ECFP 的 C155。莫些荧光蛋白片段具有多重互补特性，能够与两种以上 其它片段互补，如EYFP的N173能够与EYFP的C173、C155 和ECFP的C155形成荧光复合物。但并非所有的荧光蛋白的氨基末端片段与竣基末端片段 之间都能产生互补，至今尚未观察到GFP的氨基末端片段与 竣基末端片段能形成荧光复合物：8 o2.2.2 BiFC的光谱特性 荧光蛋白的三肽生色团结构 （65-6

8、7位氨基酸）位于氨基末端片段内，双分子荧光复合 物的光谱特性主要取决于氨基末端片段。来源于同一荧光蛋白的互补片段形成的荧光复合物的激 发光谱和发射光谱与对应的完整的荧光蛋白光谱一致，在莫 些情况下有红移现象发生，这可能与互补片段组装过程中生 色团周围的氨基酸排列产生一定改变有关： 9o来源于不同荧光蛋白的互补片段形成的双分子荧光复合 物的激发光谱和发射光谱介于其来源的两种荧光蛋白光谱 之间，与氨基末端片段来源的荧光蛋白光谱接近。总之，相对于天然荧光蛋白，双分子荧光复合物的荧光 强度有不同程度的减弱。2.3互补片段的研究进展自BiFC发现以来，最早确认的12种互补片段组合来源于 EGFP、EYF

9、P、ECFP 7, 分属7个不同的光谱类型。这些互补片段标记的融合蛋白载体转染细胞并稳定表达 后，必须在低温下（30 C）预孵化0-24 h以促进互补片段 组装形成的生色团成熟。为克服低温引起的应激刺激的影响，科学家们不断寻找 新的性能优异的荧光蛋白互补片段。现已证实YFP的两个新的突变体 Citrine和Venus以及ECFP的改进型荧光蛋白Cerulean,其氨基末端片段与竣基末端片段的所有组合均能在37 C生理培养条件下产生荧光互补8,这不仅明显缩短了反应时间，使形成的双分子荧 光复合物的荧光强度提高 2倍以上，并且需要转染的质粒数 量也大大减少。在已经发现的互补片段组合中，目前认为最有

10、效、并推 荐使用的互补片段组合及其光谱特点：10见表1。表1推荐使用的互补荧光片段组合 3 BiFC的应用特点 基于BiFC的原理和互补片段的特性，BiFC技术的应用具有 如下特点1在活细胞生理环境中直接、原位显示蛋白质相互 作用产物。2不同的双分子荧光复合物之间的光谱差异能够满足以 不同的颜色在同一细胞中同时显示多种蛋白质间相互作用 的需要。(3) BiFC分析适用于可形成二聚体或共价结合的蛋白 质间的相互作用，包括肽、核内蛋白、泛素家族蛋白、信号 蛋白、酶复合物、膜蛋白、核酸结合蛋白、植物蛋白、植物 病原体。能鉴定新的蛋白质间的相互作用而无需了解其相互作用 有关结构基础的先验知识。(4)荧

11、光蛋白片段与待检蛋白构成的融合蛋白在哺乳动物细胞、植物、微生物中都获得了成功的表达(5)双分子荧光复合物的形成不需要外加底物和辅助 因子，使蛋白质相互作用的检测对细胞的干扰降低到最小程 度。(6) BiFC具有的灵敏度足以检测与内源性表达水平相 当的蛋白质间的相互作用，从而使实验结果更真实地反映天 然蛋白的特性。(7)除普通荧光显微镜外，利用 BiFC进行蛋白质相互 作用分析不需要特殊仪器，实验结果也不需要进行复杂的数 据处理或荧光校正。4 BiFC的应用现状 4.1用于蛋白质相互作用的亚细胞 定位不同蛋白质通常分布在细胞的不同部位，成熟蛋白质必须在特定的细胞部位才能发挥其生物学功能。细胞周期

12、的调控过程、细胞的信号转导和转录调控，都 依赖于蛋白质空间位置的变化和运动。利用BiFC分析能够获取活细胞中蛋白质相互作用复合物 的亚细胞定位信息，从而为我们推断蛋白质的生物学功能提 供必要的基础。利用BiFC对多种不同结构的转录因子之间的相互作用 及其亚核定位的研究发现，在多数情况下，转录因子相互作 用形成的复合物在胞核的分布相对于未发生相互作用时发 生明显改变，由此证实了转录因子之间的相互作用对其亚核定位具有调控作用：6,11-12在蛋白质相互作用复合物亚细胞定位的调控研究方面， BiFC也显示由强大的优势。Hu CD等发现Jun与转录激活因子 ATF2相互作用形成的 异源二聚体在应力活化

13、蛋白激酶刺激下从胞浆易位到胞核 ：6oBiFC还应用于蛋白质复合物向不同的亚细胞区域募集的 可视化研究，如鸟喋吟核昔酸交换因子GBF1与ADP核糖基化因子ARF1形成的复合物在布雷菲德菌素A的刺激下向高尔基体募集13; BCL2家族蛋白BIF1和BAX相互作用产 物在细胞凋亡诱导下重新定位于线粒体：14。4.2 在单细胞中同时显示多种蛋白质间的相互作用利用不同的双分子荧光复合物之间的光谱差异，在单细胞中以 不同颜色同时显示多种蛋白质间的相互作用产物，称为多色 BiFC 分析：7o多色BiFC分析的主要应用为(1)利用不同的互补片段 组合显示多个二聚化蛋白复合物在一细胞中的分布。2利用莫些荧光蛋

14、白片段具有两个以上互补片段的多重 互补特性，研究多个功能各异的蛋白质与共同的相互作用配 偶体之间竞争结合。(3)通过比较具有不同光谱特点的荧光复合物之间的相 对荧光强度，确定多个蛋白质相互作用复合物形成的相对效率。Fos、Jun以及转录激活因子 ATF2三者的所有配对组合均 能发生二聚作用，在细胞中调节不同的基因转录。通过多色BiFC分析对Fos、Jun及ATF2之间交互作用 相对效率的比较表明， 在哺乳动物活细胞中，bFos-bJun异源 二聚体形成的效率比 bFos-bATF2和bJun-bATF2更高：7。在 Myc/Max/Mad 转录因子调节网络中，Myc和 Mad家族蛋白均通过与

15、Max蛋白的二聚作用分别实现对细胞生长 和增殖的正向和负向调节，Myc和Mad家族蛋白同时与 Max 发生二聚作用的竞争结果最终决定Myc/Max/Mad网络对细胞增殖的调控。Grinberg 等12利用多色 BiFC 对 Max-bMyc 和 Max-Mad 二聚体形成的相对效率进行分析，发现 Mad3-Max异源二聚 体形成效率低于 bMyc- Max ,而Mad4-Max异源二聚体形成 效率高于bMyc- Max ,从而揭示 Mad3、Mad4对细胞生长增 殖的不同调控机制。4.3 鉴别酶-底物复合物 在酶-底物的相互作用中，底物 特异性以及酶作用部位的识别有助于其新功能的发现。Blon

16、del 15等利用BiFC技术研究泛素E3连接酶Grr1 与胞质分裂调控因子 Hof1在酿酒醉母有丝分裂期的相互作 用，发现Grr1诱导的Hof1降解是醉母胞质分裂过程中引起 肌动球蛋白收缩的重要步骤。BiFC也成功用于激酶、鸟喋吟核昔酸交换因子与底物相 互作用的鉴定：13,16。4.4 信号转导级联 借助于BiFC技术，许多信号蛋白分 子在信号转导网络中的相互作用研究也不断深入。转录因子SMAD家族是转化生长因子 TGF- B的细胞内信 号转导分子，通过 BiFC分析发现，SMAD3与SMAD4结合 形成的异聚体进入胞核，发挥对靶基因的调节作用；而 SMAD3与AKT/PKB 的结合却阻止其

17、向核转运： 17。BiFC技术对于研究细胞膜环境对膜蛋白相互作用的潜在 影响也具有独特的价值：18-19,发现一些与人们预期相反 的实验结果，如膜蛋白的流动性既不会扰乱发生于其中的相 互作用的特异性，也不影响荧光蛋白片段的结合。4.5 翻译后修饰许多蛋白质之间的相互作用取决于特定的翻译后修饰，如澳区包含蛋白Bromodomain家族成员 BRD2与乙酰化组蛋白 H4之间的结合必须以 BRD2含有澳 基域、同时组蛋白 H4具有含乙酰化作用位点的尾部结构为 前提：20。ERGIC53受体与组织蛋白酶 C或组织蛋白酶Z之间的相 互作用必依赖于 ERGIC53受体的lectin结合域以及配体的糖 基化

18、21。因此，通过荧光互补现象的观察能够直接检测蛋白质相 互作用所必需的特定的翻译后修饰是否发生4.6 相互作用配偶体的筛选基于BiFC进行蛋白质相互作用配偶体筛选的优势在于不仅可在活细胞生理环境中检 测目标蛋白的相互作用，并且能直接反映各种刺激因素对相 互作用的影响。其主要局限为不同实验条件下蛋白表达水平的差异可能影响鉴定结果。总的来说，BiFC极有希望成为特定细胞环境中相互作用 蛋白质配偶体的鉴定方法，也可用于调控蛋白质相互作用的 合成分子或细胞因子的鉴定。Remy 22等采用基于 BiFC的基因库筛选方法，已筛 选由AKT/PKB的作用配偶体Ft1蛋白。4.7 泛素与蛋白底物共价结合的可视

19、化研究泛素及其类似物ubiquitin-like modifiers , ubls与各种底物蛋白形成 共价结合以后，通过介导蛋白质降解以及改变蛋白质的细胞 定位、蛋白质的酶活性、蛋白质之间的相互作用影响这些底 物的功能与活性。泛素/ubls与靶蛋白质之间的共价结合能够促进与其融合 的荧光蛋白互补片段结合而形成荧光复合物。尤其是当细胞内存在大量未修饰蛋白质的高表达时，利用BiFC能够选择性地显示那些发生泛素化修饰的蛋白质小 亚群。Jun蛋白与泛素家族不同成员相互作用的BiFC分析显示23, Jun蛋白与泛素的共价结合使 Jun蛋白从核转移到胞 浆溶酶体小囊泡，Jun蛋白与泛素类似物 SUMO1的

20、结合使 Jun蛋白从核质和核仁转运到亚核部位，并且 Jun蛋白与泛 素、SUMO1的共价结合产物在同一细胞内的分布无重叠。利用BiFC技术对泛素/ ubls与蛋白底物结合产物进行可 视化，将成为研究活细胞生理环境中蛋白底物的泛素化及其 对蛋白底物生理功能调节作用的有力工具。5问题与展望 从2002年首次报道以来，BiFC技术在理 论基础和应用方面取得了很大进展，但作为一种新近发展的 用于蛋白质间相互作用研究的方法，BiFC技术本身还存在一些局限10, 24,如互补片段之间可能发生不依赖蛋白质问 相互作用的自发结合而产生背景荧光；互补片段重新组装形 成成熟的生色团往往需要数小时，限制了 BiFC

21、技术对蛋白 质相互作用的实时检测；互补片段结合的可逆性尚存在争议 等。可喜的是，经过相关领域科学家的努力，上述问题的解 决已初现曙光。大量研究证实来源于 EYFP的YN155-YC155是一对特异 性较高的互补片段，在其标记的蛋白质发生相互作用时互补 效率很高，反之荧光非常微弱：6。Demidov 9等通过克隆 EGFP 的 1-158、159-238 氨基 酸序列作为互补片段研究核酸杂交，在数分钟后观察到荧光，表明氨基末端片段内生色团的自身催化和成熟能够在数分钟内完成。Anderie等发现actin/actin双分子荧光复合物具有可逆性 25。这些研究表明BiFC完全可能用于蛋白质相互作用的

22、实时 研究及其动力学特性分析。我们相信，随着BiFC基础理论研究的深入和新的性能优 异的互补片段的发掘，BiFC技术必将在蛋白质相互作用以及 翻译后修饰的研究中具有更加广泛的应用前景。【参考文献】1 Drewes G, Bouwmeester T. Globalapproaches to protein-protein interaction J.Curr Opin Cell Biol, 2003,152199-205.： 2 Collura V, Boissy G. Fromprotein-protein complexes to interactomics J. Subcell Bioch

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