木瓜蛋白酶提取实验记录

1、木瓜蛋白酶实验记录2016.11.3实验前准备：所需试剂的配制：饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4冰箱中。酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。预实验：确定实验的可行性酶液提取：用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为23mm，根据果实大小的不同，每个果实可以510条刀口。将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。浆液用8层纱布

2、进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20存取10ml酶原液。分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。编号酶液+保护剂（ml）硫酸铵粉末（20%）（g）硫酸铵粉末（40%）（g）酶液+保护剂（ml）冷无水乙醇（60%）（ml）酶原液132+251.0调节ph为6.0，4静置6小时酶原液232+28.375静置30min，离心4000r/min、30min弃沉淀上清（编号酶液1）9.3125静置30min，离心4

3、000r/min、30min取沉淀，加蒸馏水至10ml取3ml酶液，-20保存7+112.0对静置的酶液继续处理酶液+保护剂（ml）饱和硫酸铵（20%）（ml）饱和硫酸铵（40%）（ml）蒸馏水（ml）酶原液14静置过夜4000r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水取3ml酶液（编号酶液2），-20保存7+1置冰桶中2.7静置30min,离心4000r/min,30min，弃沉淀8静置30min,离心4000r/min,30min，取沉淀10编号酶液3，-20保存酶原液2编号酶液5，-20保存201611.4试剂配制考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g

4、考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。重提木瓜蛋白酶实验设置对照一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为23mm，根据果实大小的不同，每个果实可以510条刀口。将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。浆液用8层纱布进行过滤,

5、将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20存取10ml酶原液（编号为酶液1）。分装木瓜蛋白酶原液，加入适量酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。酶液+保护剂（ml）饱和硫酸铵（20%）（g）饱和硫酸铵（40%）（g）酶液+保护剂（ml）冷无水乙醇（65%）（ml）酶原液370+10148.6调节ph为6.0，4静置6h酶原液470+10置于冰桶中20静置30min，离心4000r/min，30min，弃沉淀上清（编号酶液B2.2）22静置30min

6、，离心4000r/min，30min，取沉淀，加10ml蒸馏水取1ml酶液上清（编号酶液B3.3）沉淀（编号酶液B4.4），-20保存9+118.6对静置处理后酶液继续处理酶液+保护剂（ml）饱和硫酸铵（20%）（g）饱和硫酸铵（40%）（ml）酶原液34静置6h4000r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液B5.5），-20保存9+1置冰桶中2.5静置30min,离心4000r/min,30min，弃沉淀上清（编号酶液B6.6）2.7825静置30min,离心4000r/min,30min，取沉淀，加入10ml蒸馏水取1ml酶液上清（编号酶液B7.

7、7）沉淀（编号酶液B8.8），-20保存酶原液4编号酶液B9.9，-20保存2016.11 5试剂配制标准蛋白质溶液（0.1mg/mL）:准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释到100mL。现配现用。酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.2g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液160mL（取2.866g磷酸氢二钠固体加160mL蒸馏水即得溶液），置沸水浴中煮30min，时时搅拌，冷却至室温。加1M盐酸调节PH至7.00.1 。加蒸馏水稀释到200mL。用前配置。酶稀释液：A液 称取半胱氨酸2.635g，氯化钠11.7g，加蒸馏水250mL溶解 ；B液 称取乙二胺四乙酸二钠1.115g，加蒸馏水10

8、0mL溶解；合并A、B液，搅拌均匀，用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PH值到5.5，加蒸馏水稀释至500mL 。用前配置。三氯乙酸溶液：取三氯乙酸3.6g，加乙酸钠5.98g和冰乙酸3.8mL，加水溶解并稀释至200mL。酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml，稀释至3mL。操作 待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL，分别置于2支10mL带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL，立即振摇，置50

9、度水浴中，精确反应10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A。 空白对照液：再精确量取酶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min，准确加入50度预热的蒸馏水5ml, 置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。 酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸馏水为空白，在275nm的波长处测定吸光度An。分别测量酶液的酶活力管号AA0酶液11

10、.161 1.175 0.291 酶液20.492 0.487 0.249 酶液40.992 1.388 0.259 酶液51.235 1.408 0.325 酶液91.016 1.138 0.194 酶液B20.451 0.429 0.312 酶液B40.962 1.005 0.219 酶液B51.211 1.130 0.224 酶液B80.511 0.304 0.314 酶液B91.325 1.175 0.205 由于吸光度大于1,对测定结果影响较大故结果不能使用2016.11.9重提木瓜蛋白酶用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为23mm，根据果实大小的不同，每个果实可

11、以510条刀口。将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。收集10ml乳汁加入100ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20存取3ml酶原液（编号为酶液1）。分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。40%饱和硫酸铵提取酶液1酶液+保护剂（ml）饱和硫酸铵（20%）（ml）饱和硫酸铵（40%）（ml）酶液+保护剂（ml）冷无水乙醇（60%）（ml）酶原

12、液320+233调节ph为6.0，4静过夜酶原液420+2置于冰桶中5.5静置30min，离心4000r/min，30min，弃沉淀上清（酶液2）9.1静置30min，离心4000r/min，30min，取沉淀，加10ml蒸馏水上清（酶液3）沉淀（酶液4）取1ml酶液，-20保存9+118.645%饱和硫酸铵提取酶液1酶液+保护剂（ml）饱和硫酸铵（20%）（ml）饱和硫酸铵（45%）（ml）酶液+保护剂（ml）冷无水乙醇（60%）（ml）酶原液320+233调节ph为6.0，4静过夜酶原液420+2置于冰桶中5.5静置30min，离心4000r/min，30min，弃沉淀上清（酶液2）12.

13、5静置30min，离心4000r/min，30min，取沉淀，加10ml蒸馏水上清（酶液3）沉淀（酶液4）取1ml酶液，-20保存9+118.62016.11.10试剂配制500ml的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取10g的碳酸氢钠和0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。500ml的1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。对过夜的酶液继续处理40%饱和硫酸铵提取酶液+保护剂（ml）饱和硫酸铵（20%）（ml）饱和硫酸铵（40%）（ml）酶原液34静

14、置过夜4000r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液5），-20保存9+1置冰桶中2.5静置30min,离心4000r/min,30min，弃沉淀上清（酶液6）4.166静置30min,离心4000r/min,30min，取沉淀，加入10ml蒸馏水取1ml酶液，-20保存上清（酶液7）沉淀（酶液8）酶原液4编号酶液9，-20保存45%饱和硫酸铵提取酶液+保护剂（ml）饱和硫酸铵（20%）（ml）饱和硫酸铵（45%）（ml）酶原液34静置过夜4000r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液5），-20保存9+1

15、置冰桶中2.5静置30min,离心4000r/min,30min，弃沉淀上清（酶液6）5.68静置30min,离心4000r/min,30min，取沉淀，加入10ml蒸馏水取1ml酶液，-20保存上清（酶液7）沉淀（酶液8）酶原液4编号酶液9，-20保存8000-14000标号的透析袋处理：取透析袋剪成适当长度的小段。 放入大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。用蒸馏水彻底漂洗透析袋。放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套，在

16、透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。系好透析袋的一端，从另一端注入酶液，将透析袋放入蒸馏水中，在摇床上震荡，时时换蒸馏水。直至向蒸馏水中加入氯化钡溶液，无沉淀产生及透析除盐完成。取出蛋白质溶液。60%乙醇45%饱和硫酸铵60%乙醇透析膜处理45%饱和硫酸铵60%乙醇40%饱和硫酸铵40饱和硫酸铵60%乙醇酶液1酶液5酶液8酶液4酶液9酶液1酶液5酶液8酶液4酶液9酶液(45%乙+硫)番木瓜透析膜处理透析膜处理透析膜处理酶液(45%硫+乙)酶液(40%乙+硫)酶液（40%硫+乙）2016.11.11酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/

17、L盐酸溶解并定容至100mL。（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.1ml酶液，加酶稀释液0.9ml，稀释至1mL。操作酶活力单位（U）定义：在以上条件下,每分钟水解酪蛋白生成1酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位（U）。公式： 酶活力（U）=A-A0AnxW1x11xn ÷10式中:1酪氨酸标准液的浓度(/ml);10反应时间;11测定总体积;n待测液的稀释倍数;分别测量各样品酶液的酶活力，结果如下：加标准编号稀释倍吸光度待测液空白对照酶液1100001.3480.328酶液2137500.2700.226酶液3183000.2940.228酶液450000.2740.193

18、酶液550000.2840.201酶液669400.5330.432酶液711090.4550.341酶液873000.4370.397酶液955600.4790.308酶液873000.4380.382酶液955600.4330.314酪氨酸标准液0.579硫酸铵法+乙醇法乙醇法+硫酸铵法硫酸铵一次纯化上清57,469.7755乙醇沉淀39,421.4161硫酸铵二次纯化上清11,473.0570硫酸铵一次纯化上清31,643.5233硫酸铵二次纯化沉淀38,471.5026硫酸铵二次纯化上清12,009.3783乙醇沉淀62,850.0863硫酸铵二次纯化沉淀27,737.4784透析90

19、,313.9896透析40,954.46271、 酶质量的测量：考马斯亮蓝G-250法测蛋白含量取8支15 mL试管，按下表加入试剂管号12345678蛋白质标准溶液（ml）00.10.20.30.40.60.81.O蒸馏水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考马斯亮蓝（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质含量（ug）0102030406080100将试管摇匀，放置2-3分钟。用分光光度计比色测定吸光值A595nm。(注意应在1小时内完成比色)，以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。测得的数据如下表用倍比稀释的方法找出酶液测吸光

20、度的最适倍数，再从新取样测量，取1ml酶液于试管中，再加4ml考马斯亮蓝溶液，混匀，静置5min后在A595下测吸光度，再根据标准曲线算质量。SDS-PAGE电泳试剂配制： 30%丙烯酰胺(Acr)：称Acr29.0g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)1.0g，加蒸馏水至100mL，过滤后置棕色瓶中，4贮存可用1-2月。 10%十二烷基磺酸钠(SDS): 称取SDS固体10g加蒸馏水溶解定容至100mL。 1.5mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50mL水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100mL。分离胶缓冲液，含0.4%SDS。 1mol

21、/LpH6.8Tris-HCl缓冲液（浓缩胶缓冲液）：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100mL。 1×SDS电极缓冲液（0.1%SDS-0.025mol/LTris- 0.192mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至2000mL。 10%过硫酸铵(AP):称取0.5gAP加蒸馏水溶解定容至5mL。 TEMED（四甲基乙二胺）。固定液：取50%乙醇454mL，冰乙酸46mL混匀。考马斯亮蓝R250（SDS-PAGE专用）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250mL，过滤后备用。脱色液：冰乙酸75mL，乙醇50mL，加蒸馏水定容至1000ml。（1） SDS-PAGE电泳具体实验步骤1. 实验前准备对蛋白质溶液进行取样，部分溶液进行浓缩，使其蛋白质含量提高，条带更加明显 配制所需试剂；清洗玻璃胶板、梳子，要使与胶接触的一面玻璃板没有残余的胶并用蒸馏水多次冲洗风干不能有颗粒杂质；查阅相关资料对所用胶的浓度进行分析，已知木瓜蛋白酶的分子量为21KD-23KD