VLDL-R及其检测方法

1、VLDL-R及其检测方法及其检测方法极低密度脂蛋白受体概念 极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)是一种多功能、高亲和力的脂蛋白受体，属LDL受体超家族的一员，它负责结合富含apoE的脂蛋白(VLDL，一VLDL，CM残粒等)，参与甘油三酯的代谢，是机体摄取血液中富含TG的脂蛋白的主要受体。结构特点 VLDL-R基因定位于9p24,含19个外显子, 18个内含子,长约40 kb。除了一个编码LBR附加重复序列的附加外显子之外，VLDL-R的外显子-内含子的分布几乎和LDL受体基因相同。但LDL-R基因位于19号染色体而VLDL-R位于9号染色体上。完整的VLDL-R结构包含5个结构域:配体结合结构

2、域;表皮生长因子前体同源结构域;O-糖链结合结构域;20个氨基酸组成的跨膜结构域;胞内域 亚型： 根据由第16外显子编码的O-糖链结合结构域有无,将VLDL-R分为两种亚型 I型受体：主要分布于心肌，骨骼肌和脂肪组织等脂代谢旺盛的组织，可能主要参与脂质代谢。 型受体：主要分布于脑、肺、脾脏、肾脏等非肌组织，可能具有脂质代谢以外的其它生物学功能 最近有研究发现,通过选择性剪切,除了上述2种VLDLR还存在其他变异体。 型受体：缺少由第4个外显子编码的配体结合结构域 型受体：则同时缺少第4、16个外显子 功能 根据报道，VLDL-R参与脂蛋白代谢、动脉粥样硬化、代谢综合征、并可能涉及信号传导、血管

3、生成以及肿瘤生长，但具体作用机制有待进一步阐明。 脂蛋白代谢 VLDLR结合含ApoE的TG脂蛋白能力很强。VLDLR通过识别apoE和LPL介导VLDL、-VLDL的摄取。巨噬细胞的VLDLR不受细胞内TG和CE(胆固醇酯）含量的调节,即负反馈抑制,巨噬细胞可不断提取VLDL,导致细胞内TG和CE大量堆积,使其泡沫化。VLDL-R提升清除ILD的能力，使血浆IDL/LDL比值显著下降。可清除餐后甘油三酯。 动脉粥样硬化 在动脉粥样硬化区域，VLDL-R主要在巨噬细胞中表达，VLDL-R可能是巨噬细胞-VLDL受体，而对泡沫细胞形成有相当的作用。 代谢综合征 VLDL-R敲除小鼠大块脂肪组织中

4、度减少。VLDL-R缺乏会导致高卡路里饮食喂养的小鼠血浆甘油三酯升高。VLDL-R缺乏与血浆LPL活性下降同时出现可能与胰岛素缺乏的糖尿病人的严重高脂血症有关。这些数据显示，脂肪组织中VLDL-R表达抑制可能有助于糖尿病治疗。 信号传导 除了apoE LPL，VLDL-R还可以结合受体相关蛋白（RAP），血小板反应素-1等等 血管生成以及肿瘤生长 VLDL-R转染COS-7细胞，发现VLDL-R抑制细胞生长，是配体依赖性的。学习本课题中几点不成熟的疑问学习本课题中几点不成熟的疑问 1、 富含TG的脂蛋白(TRL)是As的独立危险因子 ， VLDL-R被认为主要参与TG代谢。有些研究表示降低TG

5、不能降低冠心病风险（？），VLDL-C独立于TG而增加冠心病风险。本研究能否证明VLDL-C是否独立于TG作用于动脉粥样硬化。在研究“VLDL-R及基因多态性和VLDL、VLDL-C对AS的影响”时TG以及其他AS危险因素是否应作为混杂因素予以考虑？2、VLDL-R的基因多态性可能通过影响VLDL-R的数量或功能而影响人群对VLDL和VLDL-C致动脉粥样硬化的易感性，我们的研究思路可否理解为：基因VLDLRVLDL、VLDL-CAS? 但有些研究表明： AS组与正常组VLDL-R的等位基因频率、基因型频率分布无显著性影响VLDL-R因素包括VLDL、白细胞介素、低氧的生理情况等，VLDL或-

6、VLDL可能是导致VLDLR表达上调的始动因素始动因素，即VLDLVLDL-R基因表达VLDL-RTRL摄入AS. 也因此，我们分析VLDL-R与VLDL和-VLDL以及VLDL-C水平的相关性，两者相关后如何确定VLDL-R与VLDL的因果关系？3、本研究测定血淋巴细胞的VLDL-R水平 ，相关研究表明：与动脉粥样硬化相关的细胞并不包括血淋巴细胞，动物实验中发现动脉斑块组织中VLDLR表达大幅升高，但并未说明血淋巴细胞中VLDL-R也升高。所以测定的VLDL-R水平是否具有代表性？VLDL-R检测方法检测方法RT-PCR （逆转录聚合酶链反应） 将RNA的反转录反应和PCR联合应用的一种技术

7、。首先以RNA为模板，合成cRNA，再以cRNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获取目的基因及对已知序列的RNA进行定性定量分析的最有效的方法之一。WB（免疫印迹）FC（流式细胞术） ELISA （酶联免疫吸附试验 ）ELISAELISA基本原理基本原理 它采用它采用抗原与抗体的特异反应抗原与抗体的特异反应将待测物与将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。以是抗原。 3 3种必要的试剂：种必要的试剂： 固相的抗原或抗体（固相的

8、抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物） 酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）ELISA原理图原理图 固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂） 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，

9、当偶联物与固相载体留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶再加上酶的相应底的相应底物，即而物，即而呈颜色起呈颜色起催化水解催化水解或氧化还或氧化还原反应。原反应。ELISAELISA的种类的种类（一）夹心法（一）夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法（四）捕获法（四）捕获法测测IgMIgM抗体抗体（五）（五）亲和素和生物素的亲和素和生物素的ELISAELISA 双抗体夹心法双抗体夹心法 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。其原理是将特异性抗体包被在固相载体上，与其原理是将特

10、异性抗体包被在固相载体上，与待测样品中相应抗原相结合，再加入酶标记的待测样品中相应抗原相结合，再加入酶标记的特异抗体。这种方法欲检测样品必须有特异抗体。这种方法欲检测样品必须有2个可个可以与抗体结合的位点：一个与固相抗体结合，以与抗体结合的位点：一个与固相抗体结合，一个与酶标记抗体结合一个与酶标记抗体结合。双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法测抗体原理与双抗体夹心法测抗双抗原夹心法测抗体原理与双抗体夹心法测抗原原理类似，不同的是包被固相载体用的是抗原原理类似，不同的是包被固相载体用的是抗原，与待检样品结合的是酶标抗原。原，与待检样品结合的是酶标抗原。 间接法是检测抗体最常用的方法。其原理为间接

11、法是检测抗体最常用的方法。其原理为将将抗原包被在固相载体上，与待测样品中相应抗体抗原包被在固相载体上，与待测样品中相应抗体相结合，再加入酶标记的抗抗体相结合，再加入酶标记的抗抗体（抗体分子作为抗（抗体分子作为抗原诱导机体产生的第二抗体），最后加底物显色。原诱导机体产生的第二抗体），最后加底物显色。间接法间接法竞争法竞争法 此法可用于抗原此法可用于抗原和半抗原的定量和半抗原的定量测定，也可用于测定，也可用于测定抗体测定抗体 。其原。其原理为将包被抗原理为将包被抗原或抗体的固相分或抗体的固相分为为2 2组，一组加入组，一组加入酶标记抗原酶标记抗原/ /抗体抗体和待测抗原和待测抗原/ /抗体，抗体，

12、一组只加入酶标一组只加入酶标记抗原记抗原/ /抗体，比抗体，比较两组底物降解较两组底物降解量。量。捕获法捕获法测测IgMIgM抗体抗体 血清中针对某些抗原的特异性血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性常和特异性IgG同同时存在，后者会干扰时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异（包括异性性IgM和非特异性和非特异性IgM）固定在固相上，在去除）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性后再测定特异性IgM。亲和素和生物素的亲和素和生物素的ELISAELISA ABS-ELISAABS-ELIS

13、A是在常规是在常规ELISAELISA的原理的基础上，结合生物素与亲的原理的基础上，结合生物素与亲和素间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。和素间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是亲和素是1 1种糖蛋白种糖蛋白，由由4 4个亚基组成，个亚基组成，对生物素有很高的亲和力对生物素有很高的亲和力. .由于由于1 1个亲和素能与个亲和素能与4 4个生物素结合，所以把个生物素结合，所以把ABS-ELISAABS-ELISA分为：分为： 酶标记亲和素酶标记亲和素- -生物素法（生物素法（LBALBA），）， 桥联亲和素桥联亲和素- -生物素法生物素法（ABC)ABC)。抗原固相抗体ELISA法定量测定法定量测定VLDL-R含量含量实验原理实验原理用纯化的用纯化的VLDL-RVLDL-R抗体包被微孔板，制成抗体包被微孔板，制成固相载固相载体体，往微孔中依次加入，往微孔中依次加入标本或标准品标本或标准品、生物素、生物素化的化的抗抗VLDLRVLDLR抗体抗体、HRPHRP标记的标记的