医学科研思路与方法期末考试设计报告模板

1、医学科研设计报告书研究名 称：迷走反射调节胰腺分泌的神经传递机制研究作者：王二、李四班级：电话：电子信箱(Email):日期：2012年5月1日一、立论依据(包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处) 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。餐后胰腺分泌是食物消化吸收过程中的重要组成部分，目前认为这一过程主要由内分 泌激素胆囊收缩素(CCK)及迷走-迷走反射作用于胰腺的迷走神经胆碱能节后神经调节 1-3。但餐后迷走神经信号的上传、中枢整合后控制胰腺分泌信号的下传神经

2、通路及在这一 M路中参与的神经递质还未阐明，病理研究证实迷走神经初级传入纤维位于肠上皮以下粘 M固有层内，提示肠道接受刺激后并不直接作用于迷走神经传入纤维，而通过间接途径起 作用。5羟色胺(5-HT)为传递内脏感觉的神经递质，美国 Michigan大学胃肠肽研究中心 报道迷走神经初级传入纤维含有大量CCK-A及5-HT3受体，肠道内的刺激，如碳水化合物、高渗盐水及粘膜磨擦等，可导致肠粘膜嗜铭细胞( EC)释放5-HT ,继而作用于迷走传入 神经末梢的5- HT3受体，引起迷走反射主导的胰腺分泌4-6。迷走感觉神经元细胞内电生理记录进一步发现5-HT与CCK可能协同作用刺激迷走神经传入纤维7。然

3、而这种信号如何上传以及参与其传递过程的神经递质仍不清楚。迷走神 经节(vagal nodose ganglia)及孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS)为迷走传入的重要 部位。迷走神经节及孤束核内均有多种神经递质，研究发现谷氨酸盐( glutamate, Glu)及 P物质(substance P, SP)在迷走神经节内合成并释放至孤束核8,而起兴奋性神经递质作用。Glu及SP是否参与肠道刺激后迷走神经的信号传入尚未见报道。我们推测肠道刺激后，肠道EC细胞释放5-HT, 5-HT作用于迷走初级传入神经末梢的5HT3受体，兴奋迷走传入神经，将信号传至迷走神经节，

4、迷走神经节利用 Glu及SP作为兴奋性神经递质将信号传至M束核。因此，在本研究的前半部分，我们将通过肠腔刺激观察迷走神经节内兴奋性神经 元神经递质 Glu及SP的表达，并通过神经元细胞内电生理记录证实Glu及SP作为兴奋性神经递质参与信号上传。同时孤束核内 Glu及SP受体表达增加，电生理记录确定兴奋性神经元，通过神经元染色证实迷走传入神经将Glu主SP作为兴奋性递质将外因刺激的信号传，中枢。中枢对胰腺分泌功能的调节主要是通过迷走运动背核( dorsal motor nucleus, DMN )发 出的副交感 运动神 经起作用。以往零星的研究发现DMN 微量注 射甲状腺素激素 (thyrotr

5、opin-releasing hormone, TRH )能刺激胰腺分泌9,而胰多肽(pancreatic polypeptide, PP)则能抑制胰腺分泌10。脑内注射生长抑素(somatostatin, SS)、钙调基因相关肽(calcitonin gene-regulated peptide, CGRP)及胰高血糖素类似肽( Glucagon-like-peptide-1, GLP-1 )亦对 胰腺分泌有抑制作用11-13。但各种中枢神经递质调节胰腺分泌的作用通路，它们对迷走传 “神经功能的调节、对胰腺内神经元的调控，以及特定神经递质对胰腺分泌的特异性调节 作用尚未见报道。DMN的迷走传

6、出神经对胰腺分泌的调控是非常复杂的，其一方面接受 NTS的传入信息，另一方面也接受高级中枢的控制14,此外，血循环中一些内分泌因素可通过血脑屏障薄弱处直接作用于DMN15。我们认为，DMN迷走传出神经对胰腺功能的调1 节是众多兴奋性神经递质与抑制性神经递质综合作用的结果，迷走神经传出纤维作用于胰腺内神经，后者综合各种中枢信息，调节胰腺功能。研究发现DMN迷走传出神经有多种神经递质，如乙酰胆碱、NOS及各种神经肽(VIP、NPY、GRP)等16,因此，我们推测特定的刺激可以作用于某一组迷走运动神经元，它们有特定的神经递质，这些传出纤维作 用于具有不同的特有神经递质的胰腺内神经元，从而调控不同的胰

7、腺功能。综上所述，虽然以往的研究已经发现肠道刺激后，肠粘膜 EC释放5-HT,作用于迷走传入神经末梢5-HT3受体最终引起胰腺的分泌，但这种刺激上传通路及参与的神经递质均不明确。DMN内微量注射某些神经递质已证实对胰腺的分泌功能有兴奋或抑制作用，但中枢传出对胰腺分泌的调控通路及其相关的神经递质尚不清楚。因此，我们设计了本研究， 希望能初步确定肠道刺激引起胰腺分泌的一个完整的神经通路，即肠道刺激激发迷走传入 冲动到NTS , DMN传出冲动到胰腺调节胰腺分泌功能。这一研究将证实存在脑-胰通路(Brain-Pancreas Interaction)的假说，丰富对胰腺分泌调节机制的认识，对胰腺疾病的

8、救 治具有重要的意义。参考文献1. Li Ying, Owyang C. Endogenous cholecystokinin stimulated pancreatic enzyme secretion via a vagal afferent pathway. Gastroenterology, 1994;107(2):525-5312. Li Ying, Hao Y, Owyang C. High-affinity CCK-A receptors on the vagus nerve mediates CCK-stimulated pancreatic secretion in rats

9、. Am J Physiol, 1997;273(3Pt1):G679-G6853. Li Ying, Owyang C. Pancreatic secretion evoked by cholecystokinin and non-cholecystokinin-dependent duodenal stimuli via vagal afferent fibers in rat. J Physiol, 1996;491(3):773-7824. Li Ying, Hao YB. Zhu JX, Owyang C. Serotonin released from intestinal EC

10、cells mediate luminalnon-CCK stimulated pancreatic secretion in rats. Gastroenterology, 2000;118(6):1197-12075. Li Ying, Hao YB, Zhu JX, Owyang C. Intestinal serotonin acts as a paracrine substance to mediatepancreatic secretion stimulated by non-CCK dependent luminal factors. Am J Physiol, 2001;281

11、(4):G916-G9236. Zhu JX, Wu XY , Owyang C, Li Ying. Electrophysiological evidence that intestinal 5-HT acts as a paracrineto mediate vagal signal transmission evoked by luminal factors in the rat. J of Physiol, 2001;530(3):431-4427. Li Ying., Wu YX, Owyang C. Serotonin and cholecystokinin synergistic

12、ally stimulate at vagal primary afferent neurons. Gastroenterology, 2001;120(5):A38328. Granata AR, Sved AF, Reis DJ. In vivo release by vagal stimulation of L-(3H) glutamic acid in the nucleous tractus solitarius preloaded with L-(3H) glutamine. Brain Res Bull, 1984;12(1):5-9.9. Okumura T, Taylor I

13、L, Pappas TN. Microinjection of TRH analogue into the dorsal vagal complex stimulates pancreatic secretion in rats. Am J Physiol, 1995;269(3Pt 1): G328-34二、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标肠道接受刺激后，迷走感觉神经利用谷氨酸盐（Glu）、P物质（SP）作为神经递质。研究内容肠道刺激后，迷走感觉神经神经递质传递机制利用c-Fos的表达确定肠道接受各种刺激 （碳水化合物、高渗盐水、5-HT）后，迷走神经节（vagal

14、nodose ganglia）内 的迷走感觉神经元； 通过免疫组化双重染色，观察c-Fos阳性神经元Glu及SP的表达，说明肠道刺激后迷走感觉神经 Glu及SP表达增加。拟解决的关键问题迷走神经节迷走感觉神经元内电生理记录迷走神经节迷走感觉神经元内神经微粒注射孤束核内迷走感觉神经元内电生理记录孤束核内迷走感觉神经元内神经微粒注射迷走运动背核内微量注射法迷走神经胰腺枝电生理记录双重免疫荧光标记3 2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法利用c-Fos表达阳性确定迷走神经节、孤束核、迷走运动背核及胰腺内迷走感觉神经利用免疫组化双重染色研究迷走神经节内c-Fos阳性神经元Glu、

15、SP等神经递质表达利用荧光免疫组化双重染色研究孤束核内c-Fos阳性神经元Glu受体及SP受体表达通过迷走感觉细胞的电生理记录，确定肠道刺激后被兴奋的迷走感觉神经元，免疫组化双重染色确定这些迷走感觉神经元利用Glu及SP作为神经递质。荧光免疫组化双重染色研究孤束核内被兴奋神经元Glu受体及SP受体表达技术路线肠道刺激后迷走感觉神经的神经递质传递机制可行性分析 课题组已取得本研究初步预实验结果： 肠腔灌注后，迷走神经节c-Fos表达增加，免疫组化双重染色提示c-Fos阳性神经元内Glu表达增加（图1） 已建立迷走神经节电生理记录方法（图2）,肠腔灌注5-HT后迷走神经节内神经元放电增加（图3）

16、已完成迷走感觉神经元内神经微粒注射方法，双重免疫组化染色显示迷走神经元 中富含SP （图4） 肠道灌注刺激后，孤束核内神经元c-Fos表达增加，免疫组化双重染色提示c-Fos阳性神经元Glu受体表达明显增加（图 5） 孤束核内微量注射 Glu受体阻断剂可减少肠腔灌注5-HT后胰腺分泌（图6） 胰腺内注射荧光标记 CTB,逆向追踪至迷走运动指核，见CTB免疫荧光阳性神经元，神经元内 ChAT、c-Fos、NK1受体表达增加（图 79） 建立迷走神经胰腺枝电生理记录方法，迷走运动指核内注射 NPY后电活动明显增加（图10） 迷走运动背核内微量注射SP,胰腺内神经元c-Fos表达增加，c-Fos阳性

17、神经元内ChAT表达增加（图11）上述预试验结果表明，课题组已掌握了完成本研究的关键技术，能够成功解决关键问题。3 .本项目的特色和创新之处本研究使用的免疫组化双重染色及多重染色技术、活体内电生理记录技术均为当今世界先进的技术，结合胰腺分泌功能的研究将确定一个完整的神经通路，即肠道刺激激发迷走传入冲动到孤束核，迷走运动背核传出冲动到胰腺调节胰腺分泌功能。这一研究将证实存在脑胰通路（Brain-Pancreas Interaction）的假说，丰富对胰腺分泌调节机制的认识。5 4 .年度研究计划及预测进展20012年1月2012年12月（第一年度）肠道刺激后迷走神经节C-FOS表达c-Fos阳性神经元Glu、SP表达肠道刺激后迷走神经节电生理记录迷走神经节神经元神经微粒标记及Glu、SP表达肠道刺激后孤束核 c-Fos表达 c-Fos阳性神经元Glu、SP表达2013年1月2013年12月（第二年度）肠道刺激孤束核神经电生理记录 孤束核内神经元微粒标记及Glu受体、SP受体表达孤束核内微量注射 Glu受体阻断剂对胰腺分泌的调节 胰腺内注射，逆向追踪，迷走运动背核c-Fos表达c-Fos阳性神经元 ChAT、Glu受体及SP受体的表达2014年1月2014年12月（第三年度）迷走运动背核微量注射对迷走神经胰腺枝电生理作用及胰腺分泌功能的影响 迷走运动