人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书学习资料

1、人类EGFR基因突变荧光 PCR检测试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR【包装规格】7测试/盒【预期用途】EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK ）活性，是原癌基因c-erbB-1 （ HER-1 ） 的表达产物。EGFR 的主要信号转导途 径有：PI3K-PDK 通路， RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC- y通路，JAK-STAT通路。通过这些途

2、径，将胞外信号转化为胞 内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在 EGFR酪氨酸激酶的 ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替 尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替

3、尼的药 物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸 的大约20种缺失约占所有突变的 45%，其中以两种delE746-A750（2235_2249del15和2236_2250del15）最为常 见，占到外显子19缺失总数的75%;外显子21上 L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点 突变（G719X ）约占5%;外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子 20上的T790M突变与酪氨酸激酶 抑制剂药物的耐药性相关。本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿

4、瘤靶向 治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床 诊断的唯一依据。【检测原理】本试剂盒结合特异性引物和 TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。 利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。【主要组成成分】本试剂盒具体包含组分如表 1表1编号组分份数体积（丄）119-Del （1）检测反应液1150219-Del （ 2）检测反应液11503S768I检测反应液1150420-In

5、s检测反应液11505T790M检测反应液11506L858R检测反应液11507L861Q检测反应液11508G719X检测反应液1150外控检测反应液1150r-Taq 酶130阳性对照DNA1100无菌超纯水1500【储存条件及有效期】避光，-20'C以下保存，避免反复冻融（不要超过5次），有效期6个月。【适用仪器】ABI 7300， ABI 7500， ABI 7900， ABI StepOne，ABI StepOne Plus， Rotor-Gene Q【样本要求】本试剂盒可以检测从新鲜组织及 FFPE组织中提取的DNA，DNA质量及浓度影响检测的特异性和灵敏 度。DNA的质

6、量与样本保存时间、样本组成、DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求：1、新鲜标本的制备过程中， 术后标本取下后应立即放入-20C以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程中，术后标本应在1个小时内放入10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的4-20倍，固定时间应在6-48小时之间；2、 新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于1%,尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业化 试剂盒提取DNA（AXYGEN ，QIAGEN等公司产品）。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请

7、置于 -20 C保存。3、FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取DNA（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit）。提取的 DNA 用分光光度计检测 DNA 纯度，A260/A280 在 1.6-2.0 之间，如果不能立即检测请置于-20C保存。FFPE组织样本保存年限尚未超过 3年。4、样本切片规格要求为：横切面面积至少6mnX 6mm，厚度10 pm，3片，如果切片面积小请适当增加切片数。最终提取的DNA用100让-200让水溶解，分光光度计检测浓度后，稀释或浓缩成 5-10ng/ p。【检验方法】本试剂盒可以进行5人份的检测

8、反应，并为每个样本额外提供一个参照基因扩增反应，用于估测样本实际DNA的浓度。建议每批次实验都检测一个阳性对照 （positive control）和一个无模板阴性对照（NTC）。建议 根据实验条件进行分区操作，如样品处理区，反应液配制区等。具体操作步骤如下：1.2. 将试剂盒中所有组分冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。注意：试剂盒中的所有试管在开盖前均应短暂离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。3. 每批实验根据待检测样本数、一个阳性对照、一个阴性对照，同时计算并分别配制1-8号反应液。每个反应液所需反应数=待测样本数 + 2（个阳性对照、一个阴性对照），而每个反应所需反应

9、液19.7 JL， 需r-Taq酶0.3丄，即从1-8号反应液中分别取（19.7 反应数）此于对应编号的1.5EP管，再分别加入（0.3 X 反应数）pL的r-Taq酶。注意：由于取样误差，请根据情况适当多配置0.3个反应即可。4. 将配制好的混合液轻轻充分混匀，并按照每管20 pL分装到每个PCR反应管中。5.5. 然后向每个反应管中加入5此待检测DNA、或阳性参照、或水（试剂盒提供）。待检测样本最佳浓度范 围为5ng/ pL-10ng/ pL，即每个反应管中有效 DNA总量为25-50ng。7.6. 短暂离心消除反应管中的气泡，将PCR反应管放入PCR仪。样本在PCR反应板中的布局可参见表

10、 2表2建议布局19-del(2)S768I20-InsT790ML858RL861QG719X外控突变19-del (1)1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品1样品12样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品2样品23样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品3样品34样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品4样品45样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品5样品56STDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTD7NTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTC9.打开操作软件，设置PCR扩增程序为19-del(1)19-del(2)S768I

11、20-InsT790ML858RL861QG719X阳性CT<28CT<28CT<30CT<28CT<28CT<28CT<29CT<28阴性CT>28CT> 28CT>30CT> 28CT>28CT>28CT> 29CT垄8Stagel： 95°C 5minStage2: 95 C 20s，57 C 32s，5个循环Stage3: 95C 20s, 60 C 32s , 40个循环 收集 FAM 信号注：如果使用 ABI定量PCR仪，将“Passive Reference设置为“None , “

12、report设置为“FAM, “quenche设置为 “ TAMRA【参考值】检测结果判定：1. 当样品CT值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。2. 当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。表3结果判定【实验结果的解释】1. 阈值设定：针对ABI7500机型，对以上9种检测分别设定阈值，其中 19-del，19-del(2)和G719X阈值设 定为12000，其他为300002. 阴性无模板空白对照(NTC)应无扩增曲线升起；否则表明此次实验结果无效，建议更换操作环境或反 应试剂，重新试验。(若只稍稍升起，但对结果判断无显著影响，则结果依然有效)3. 阳性对

13、照Ct值一般小于25,参照基因体系的阳性对照 CT值一般小于23,但须根据仪器型号等情况进行 判断。4. CT值确定：建议对于一个突变检测体系应同时选择参照基因反应管，STD反应管，NTC和样品反应管，一并划定阈值，从而得到外控 CT值和样品的突变CT值。5. 参照基因CT值应控制在23之前，以用于评估反应体系中的 DNA模板量。若外控CT值大于23,说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少，需重新提取或增大 DNA加入量再做。(仅对全阴性结果 而言；若已经判断为阳性，结果仍然可靠)附表:突变外显子碱基变化Cosmic ID对应检测体系E746_A750del192235-2249

14、del 1562231号反应体系E746_A750del(2)192236-2250 del 15622519-Del( 1)L747_P753>S192240-2257 del 1812370E746_T751>I192235-2252>AAT del 1813551E746_T751>A192237-2251 del 1512678E746_S752>D192238-2255 del 186220L747 A750>P192238-2248>GC del 1112422L747_T751>Q192238-2252>GCA del 151

15、2419L747 E749del192239-2247 del 96218L747 T751del192239-2253 del 156254L747 S752del192239-2256 del 186255L747_A750>P192239-2248>C del 1012382L747 P753>Q192239-2258>CA del 2012387L747 T751>S192240-2251 del 126210L747 T751del192240-2254 del 1512369L747 T751>P192239-2251>C del 1312383E746 T751del192236-2253 del 18127282号反应体系19-Del（ 2）E746 S752>A192237-2254 del 1812367E746 S752>V192237-2255>T del 1912384S768I202303G>T62413号反应体系S768IH773 V771insH202319-2320 ins CAC123774号反应体系D770_N771i