成骨成脂诱导

1、间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法浏览：185 I更新：2013-07-01 11:12间充质干细胞培养细胞诱导分化时必然用到的就是培养液，配置出合适的培养液能够促进细胞的分化，因此这一步操作时相当的关键。如何才能配置适合的诱导培养液呢？济 南中赛生物来介绍成骨与成脂诱导培养液的配备方法。成骨诱导培养液配备与诱导操作：1 .准备含10%FBS的a-MEM培养液；2 .在备好的a-MEM培养液中添加50 pM抗坏血酸，10mm,磷酸甘油和100nm地塞米 松；3 .准备6孔培养板，将P4细胞按照5 X103个/平方厘米的规格接种于原始a -MEM培养 液中；4 .待细胞长至基本融合后，

2、更换上述制备完成的成骨诱导培养液；5 .每三天换液一次，细胞长至 7天时进行碱性磷酸酶染色；6 .二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。茜素红染色方法介绍:1 .去除细胞当前使用培养液，使用 PBS清洗两次;2 .使用10%甲醛室温固定15分钟，完成后使用重蒸储水冲洗两次；3 .按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡；4 .清除掉没有完全结合的染料，用重蒸储水漂洗并振荡5min重复4次；5 .倾斜放置2min,吸取多余的重蒸储水；倒置显微镜观察拍照记录。成脂诱导培养液配备与诱导操作：1 .配置FBS10%含量的HG-DMEM培养液；2 .在配制完成的HG-DME

3、M 培养液中加入1 M 地塞米松，10四/ml胰岛素，200皿 呷 深美辛和0.5mM IBMX ;3 .准备6孔培养板，将P4细胞按照2X104个/平方厘米的规格接种于原始 HG-DMEM 培养液中4 .待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养 2大，在用只含有 10闻/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天,如此交替循环培养至14天,使用红油O 染色。红油O染色方法介绍：1.去除细胞使用的当前培养液，使用 PBS清洗两次；2.27.5%甲醛室温固定20分钟;3 .重蒸储水清洗3止匕，空气中干燥;4 .加入0.5%的红油室温孵育一小时;5 .配制70%乙醇溶液清洗3次；6 .倒

4、置显微镜观察拍照记录。丁香园二、诱导成骨体系1 .试剂 溶剂 终浓度Dex 去离子水 0.1Vc PBS50 dM50mMB -磷酸甘油 PBS10mM储存浓度 1ml体系加量1mM 0.1 it L1dL1M 10dL2. DMEMHG 和 10%FBS3. 3代以上细胞，24孔板每孔105个细胞，六孔板每孔 6000个细胞，每三天半量换液，共诱导2周。成骨诱导剂：地塞米松(1X10-8mol/L ),伊甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C50ng/ml ,高糖DMEM ,青链霉素各100u/ml ,体积分数10%的胎牛血清成骨诱导培养基成分：兔骨髓间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175 m

5、L兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL双抗2 mL抗坏血酸400匹B 甘油磷酸钠2 mL地塞米松20 dL成脂诱导培养基成分:兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基A液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基A175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL双抗2 mL胰岛素400 l LIBMX （旧MX, 3-异基-1-甲基黄喋吟）200 l L罗格列酮（口引噪美辛）200 l L地塞米松200 l L兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基B175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL双抗2 mL谷氨酰胺

6、2 mL胰岛素400 l L对成脂肪诱导要特别提醒你，用国产血清比进口的效果更好（仍为 10%浓度）。我用的是SIGMA的地塞米松（D1756 ）, 25mg包装的，248元贵的惊人！ ！须用无水乙醇溶解。我也用过病房常用的5mg的地塞米松磷酸钠，效果也挺好的。首选的是 dexamethasone-water soluble , cell culture tested。至少可以配成 1:1000的母液，使用起来很方便。使用医用制剂尤其要小心溶剂的问题，好些制剂不是融解在水里的，如果你没有设置合适的阴性对照，会给你的实验带来Bug。脂肪诱导培养液：DMEM,10%FCS, 10-6M地塞米松，1

7、00微克/ml 1一甲基一 3 一异丁基一黄喋吟，50微克/ ml抗坏血酸。很难找到一套抗兔的抗体。油红染色的方法如下：脂肪油红染色（原位）：1 .称取0.5g油红干粉，溶于100mL异丙醇中，配成0.5%油红储存液，棕色瓶保 存。2 .除去培养基用PBS洗涤1遍3 .加10%中性甲醛固定5min4 .稀释油红储存液，油红；去离子水=3:2,滤纸过滤，室温放置10min （除去一些 杂质，染色结果更清晰）5 .染色30min，如果是培养皿或培养板，加的体积覆盖住板底即可。如6孔加1.5ml ,24 孔加 0.5-1ml 06 .显微镜观察，及时照相，时间过长，脂肪滴会自发破裂，到时就前功尽弃了，几个星期的努力欧！这位大虾的油红染色方法基本正确，但有几个地方修改一下后效果会更好！第一，染色的时间减少