甘草酸苷对急性肝坏死小鼠肠分泌成分表达减少的影响及机制

1、甘草酸苷对急性肝坏死小鼠肠分泌成分表达减少的影响及机制目的急性肝坏死(acute liver failure, ALF) 时继发的感染主要由肠道细菌易位所致, 而肠道免疫屏障遭到破坏是发生肠道细菌易位的重要原因。分泌成分 (secretory component, SC) 是多聚免疫球蛋白受体(polymeric Igreceptor, pIgR)的胞外段部分,主要负责pIgA的转运和SIgA曲形成,在维护肠 粘膜免疫稳态中具有重要作用。目前研究发现，ALF时肠道pIgR/SC表达减少， 从而可导致SIgA分泌合成的减少，使其不能正常地在粘膜表面形成完整的SIgA屏障层 , 而导致肠源性感染的

2、发生甘草酸苷(glycyrrhizin), 是甘草类制剂的典型代表药物, 具有抗炎、抗氧化、抗过敏及类固醇激素样作用, 被广泛用于治疗肝病及皮肤病等领域，是否glycyrrhizin能影响肝坏死时肠SC的表达尚未见报道。本研究通过肝坏死模型观察 glycyrrhizin预先保护组小鼠肠道SC表达变化探索glycyrrhizin在预防急性肝坏死小鼠肠道SC表达减少中的作用，通过观察人结肠上皮细胞系Caco-2 在 glycyrrhizin 或在联合糖皮质激素受体抑制剂(RU486)的作用下，细胞内SC蛋白和SC mRNA勺表达情况以及glycyrrhizin 对 SC启动子活性,SC启动子结合转

3、录因子-上游刺激因子(USF)的影响，探讨 glycyrrhizin 影响SC表达的作用机制，为研究预防及治疗肝坏死时肠粘膜免疫 功能失调提供新的途径和理论依据。材料与方法一、材料1、动物：雄性Balb/c小鼠,6-8周，体重18-25克。2、细胞：Caco-2细胞。3、试剂：GalN;LPS (Ecoli O127:B8); Glycyrrhizin; 山羊抗小鼠pIgR/SC 抗体；小鼠抗小鼠B -actin单克隆抗体；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二抗；辣根过氧化物酶标 记兔抗小鼠二抗；兔抗山羊 SP试剂盒；BCAS白浓度测定液；SYBR RPrimeScriptTM RT-PCR Kit试

4、剂盒；DEX山羊抗人pIgR/SC抗体；兔抗人 B -actin多克隆抗体；兔抗人USF1多克隆抗体；兔抗人USF2克隆抗体；辣 根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二抗；FITC标记兔抗山羊二抗；胎牛血清；DMSO; RU486二、方法1、动物分组：实验动物 为雄性Balb/c小鼠，随机分为5组。1组：生理盐水(NS)对照组60只；2组： 脂多糖(LPS)对照组60只；3组：D氨基半乳糖(GalN)对照组60只；4组：急 性肝坏死(ALF)模型组60只；5组：Glycyrrhizin预保护组(LPS/GalN/glycyrrhizin) 60 只。2、细胞培养及分组：参照

5、Liu 等的方法进行细胞培养。观察浓度影响：取 6组非同代生长达融合的细胞，分别添加 0 a g/mL,4 a g/mL,20 a g/mL, 100 a g/mL 500 a g/mL,1000 a g/mL glycyrrhizin 培养24h,提取总蛋白和总RNA-130c保存；观察时间影响：取 5组非同代生 长达融合的细胞，以 100N g/mL glycyrrhizin分别处理 0h、4h、8h、16h、24h,收集Caco-2细胞爬片甲醛固定及提取总蛋白和总 RNA130c保存；取6组非 同代生长达融合的细胞，添加RU486 (50nMX合20 g/mL glycyrrhizin

6、或 100nM DEXft培养24h,收集Caco-2细胞提取总蛋白和总 RNA130c保存。3、 应用HE染色观察肝脏病理改变和电镜观察肠组织病理变化。4、应用免疫组化染色、 western blot 和 real-time PCR 方法观察glycyrrhizin 对急性肝坏死小鼠肠道SC表达下降的影响。5、应用免疫荧光染色、western blot和realtime PCR方法检测glycyrrhizin 对Caco-2细胞SC蛋白及 mRNA!达的影响。6、应用western blot 和 real-time PCR 方法研究糖皮质激素受体抑制剂（RU486）对glycyrrhizin

7、上调肠上皮细胞SC表达的影响。7、将重组质粒PGL2-SC promoter转染Caco-2细胞,通过检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达 活性，说明glycyrrhizinXt SC基因启动子活性的影响。8、应用western blot和real-time PCR 方法研究上游刺激因子（USF）及其mRNAg达，说明 glycyrrhizin是否通过影响USFS达影响SC基因启动子活性。实验结果1、肝脏HE染色观察：NS组肝细胞完整，肝血窦清晰；ALF模型组可见呈片的出血性 坏死，坏死区可见大量炎细胞，残存的肝细胞月中胀；glycyrrhizin预保护组肝脏出血坏死明显减轻，炎性细胞浸润明显减少

8、。2、肠组织电镜观察：NS组肠上皮 细胞膜完整，微绒毛排列整齐，线粒体结构正常；ALF模型组可见肠上皮细胞结 构破坏，微绒毛稀疏、断裂、脱落，细胞膜结构不完整，线粒体空泡变形，崎破坏 消失；glycyrrhizin预保护组肠上皮微绒毛仅有少量脱落，线粒体空泡变形明显减轻，细胞膜结构较完整。3、肠组织pIgR/SC免疫组化染色：PIgR/SC表达 主要定位于肠上皮细胞胞浆和胞膜上。PIgR/SC染色可见NS组呈棕黄色强阳 性；ALF模型组小鼠肠组织上皮细胞浆和膜棕黄色阳性染色明显减弱，甚至难见;glycyrrhizin预先保护组肠组织肠上皮细胞浆和膜上呈棕黄色阳性。4、肠组织SC蛋白表达west

9、ern blot半定量分析：ALF模型组SC表达较对照组明 显降低（P < 0.05）, glycyrrhizin预先保护组能有效预防急性肝坏小鼠SC表达减少，与ALF模型组相比有统计学差异（P0.05）5、肠组织SC mRN相对含量 real-time PCR 方法检测：ALF组中,SC mRNA勺表达量明显减少，与NS组有显 著差异（P0.05）。10、萤火虫荧光素酶报告基因检测SC基因启动子活性：Glycyrrhizin处理后海肾荧光素酶活性无明显改变,4h就可以看萤火虫荧光素酶活性明显增高，4h、8h、16h、24h组与对照组相比均具有统计学差异（P0.05）, 与对照组相比，各

10、组细胞USF1及USF2 mRNA达也均未见明显变化（P>0.05）。 结论1. Glycyrrhizin可以有效预防肝坏死小鼠肠上皮细胞损伤；2.Glycyrrhizin 可以有效预防肝坏死小鼠肠 SC蛋白表达减少，改善肝坏死小鼠肠 粘膜免疫稳态失调，从而保护肠粘膜上皮细胞损伤；3. Glycyrrhizin 诱导了肝 坏死小鼠肠SC基因表达，使SC蛋白合成增加；4. Glycyrrhizin 使得Caco-2 细胞pIgR/SC阳性细胞比例及pIgR/SC荧光强度增加；5. Glycyrrhizin 剂量 依赖性及时间依赖性上调 Caco-2细胞SC蛋白表达；6. Glycyrrhi

11、zin 通过诱 导Caco-2细胞SC mRNAK平，增加SC蛋白表达；7. Glycyrrhizin 上调肠上皮 细胞SC表达并非通过糖皮质激素受体；8. Glycyrrhizin 可通过增强SC基因 启动子活性来诱导Caco-2细胞SC mRN照录，促使SC蛋白表达增加；9.Glycyrrhizin并非通过上调上游刺激因子（USF）的表达增强SC基因启动子活性。同主题文章' 1.吴俊玲.人脐血移植的小鼠模型J. 国外医学.输血及血液学分册. 1998.（01）2 .利用复发性尿路感染建立PBC小鼠模型'J.现代医院.2008.（08）3 .高春芳.系统性红斑狼疮小鼠模型的研究近况J. 国外医学.皮肤性病学分册.1995.(04)4 .孔琪.表达人源VEGF-A、鼠模型的建立及抗VEGF®：体研究J. 中 国实验动物学报.2007.(02)5 .赵国际，杨郁菁，张瑞忠，顾坚忠，徐平.疑似白内障小鼠模型培育初报J.实验动物与比较医学.2008.(03)6 .赵国际，杨郁菁，张瑞忠，顾坚忠，徐平，鲍世民.遗传性BALB/c白内障 小鼠模型培育初报J. 中国比较医学杂志.2009.(08)7 .生物医学研究应慎用小鼠模型J. 广西科学.2008.(02)8 .宝福凯.在小鼠模型中探索多发性硬化的治疗'J.生理科学进展.1995.(02