DNA重组的技术基本工具huang

1、选修三 现代生物科技专题专题一 基因工程专题二 细胞工程专题三 胚胎工程专题四 生物技术的安全性和伦理问题专题五 生态工程选修三 现代生物科技专题教学目标： 简述DNA重组技术所需要三种工具的作用； 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新教学重点： DNA重组技术所需要三种工具的作用教学难点： 基因工程载体需要具备的条件课时安排：共3课时专题一什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。一、基因工程的概念一、基因工程的概念

2、1 1、原理：、原理：2 2、操作水平：、操作水平：3 3、又称：、又称：4 4、优点：、优点：基因重组基因重组DNADNA分子水平分子水平DNADNA重组技术或基因拼接技术重组技术或基因拼接技术 定向改造生物性状定向改造生物性状( (目的目的) ) 克服远缘杂交不亲和的障碍克服远缘杂交不亲和的障碍 育种周期短育种周期短5 5、技术：、技术： DNADNA重组技术和转基因技术重组技术和转基因技术1、艾艾弗里弗里证明证明DNA是遗传物质是遗传物质，DNA可从可从一种生物个体一种生物个体转移转移到另一种生物个体。到另一种生物个体。二、基因工程的诞生二、基因工程的诞生 P P2-32-3（一）基础理

3、论：（一）基础理论：2、沃森、克里克沃森、克里克建立了建立了DNA的的双螺旋结构双螺旋结构模型模型3、梅、梅塞尔松、斯塔尔塞尔松、斯塔尔证明证明DNA的的半保留复制半保留复制4、克、克里克里克等等提出提出中中心心法则：法则：DNARNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译逆转录逆转录复制复制 5、1963年年尼伦伯格尼伦伯格和和马太马太破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的遗传密码遗传密码，1966年年霍拉纳霍拉纳用实验加以证明。用实验加以证明。1)基因转移载体的发现2)的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明（二）

4、技术发明：（二）技术发明：欢迎进入朱建标老师之生命课堂7红色荧光蛋白红色荧光蛋白红色荧光蛋白基因红色荧光蛋白基因基因表达基因表达 拼接拼接三、 DNA重组技术的基本工具限制性核酸内切酶“分子手术刀”来源：主要从原核生物中分离纯化出来。种类：已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键：磷酸二酯键磷酸二酯键5 3 35限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA末端：黏性末端和平末端限制酶的识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成回文序列回文序

5、列：回文序列：一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致顺序完全一致 限制酶的识别序列：EcoRI限制酶的切割：中轴线中轴线在在G与与A之间切割之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割：中轴线中轴线黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端在在G与与A之间切割之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。C C C GC C C G G G G GG G G C C CG G G C C CSmaI限制酶的切割：只能

6、识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线中轴线你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？P4原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个磷酸二之间？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)

7、末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。作用（二 ）“分子缝合针”DNA连接酶把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.作用原理形成磷酸二酯键GAATTCCTTAAGAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG思考？DNA连接酶连接两个什么样的末端，这样的末端是经几种限制酶切开形成的？类型二 “分子缝合针”DNA连接酶类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)

8、可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的的磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别相同点相同点?只能将只能将单个核苷单个核苷酸酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段

9、片段之间之间形成磷酸二形成磷酸二酯键酯键DNA解旋酶作用呢？（三）（三）“分子运输车分子运输车”载体载体3 3、种类：、种类：1 1、需要具备的条件：、需要具备的条件：（1） 能够在宿主能够在宿主细胞中复制并稳定存在；细胞中复制并稳定存在； （2） 有一个或多个限制酶切有一个或多个限制酶切点点，且每一种的切点最，且每一种的切点最好只有一个，以便与外援基因连接；好只有一个，以便与外援基因连接；（3） 有标记基因有标记基因，便于筛选；便于筛选；（4）对受体细胞要无害对受体细胞要无害。质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒等噬菌体衍生物、动植物病毒等2、载体的作用、载体的作用将外源基因送入受体细胞。将

10、外源基因送入受体细胞。常用和最常用的载体分别常用和最常用的载体分别是？是？提示：提示：假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有酶切位点将怎样？作为载体没有酶切位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？如果载体对受体细胞有害将怎样？一般来说天然载体往往不能满足要求现在使用的几一般来说天然载体往往不能满足要求现在使用的几乎经过改造的。乎经过改造的。 问题：问题：1 1、常见载体有哪些？、常见载体有哪些？ 2、载体如何与目的基因重组在一起？、载体如何与目的基因重组在一起

11、？ 3、载体应满足哪些条件？、载体应满足哪些条件？最常用的质粒最常用的质粒大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒试分析其作为载体的优点？试分析其作为载体的优点？小结基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键 种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工工 具具具备的具备的条件条件能在宿主细胞中自我复制并能在宿主细胞中自我复制并稳定存在稳定存在具一个或多个限制酶切位点具一个或多个限制酶切位点具标记基因具标

12、记基因对宿主细胞对宿主细胞无害无害质粒、质粒、 噬菌体衍生物噬菌体衍生物 、动植物病毒、动植物病毒补充补充知识点：知识点：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起聚合酶结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADN

13、A片断，它能片断，它能阻碍阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。 P11P11RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落) )不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能编不能编码蛋白质。码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能编能编码蛋白质码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息

14、表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 补充补充知识点：知识点：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码