免疫印迹杂交

1、免疫印迹杂交（Western blot）（050302A）1仪器（1）制胶模具（2）跑胶及转膜装置（3）大小玻板（4）电泳电源（5）电磁炉2试剂：（1）Tris base、（2）SDS（3）BSA（购自Biotech）（4）Bis-acrylamide（亚甲双丙烯酰胺）（5）Acrylamide（丙烯酰胺）（6）Glycine（7）DTT（8）NaCl（购自BBI）（9）APS（购自Amresco）（10）Tween-20（温州清明化工厂）3溶液配制：（1）4 × sample Buffer终浓度Stock液10 ml 工作液0.25 M Tris-HCl, pH 6.82.5 M1

2、 ml8 % SDS20 4 ml0.2 M DTT1 M2 ml30 % glycerol100 3 ml少量的溴酚兰 1 ml管分装，-20 保存。4 ´上样缓冲液 0.5 mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2.5 ml 1 mol/L DTT 1 ml 甘油 1.5 ml SDS 400 mg 溴酚蓝 5 mg混匀后-20°C贮存备用。（2）30%储备胶溶液 丙烯酰胺（Acr） 29.2 g 亚甲双丙烯酰胺 0.8 g 混匀后加ddH2O2，37 °C溶解，定容至100 ml，棕色瓶存于4°C。（3）分离胶缓冲液1.5 M Tris-

3、HCL (pH 8.8)18.15 g Tris溶于适量的ddH2O2, 用HCL调节pH 8.8，定容至100ml，4°C保存。（4）浓缩胶缓冲液0.5M Tris-HCL(pH6.8) 6.05g Tris溶于适量的ddH2O2, 用HCL调节pH 6.8，定容至100ml，4°C保存。（5）10% SDS称取10 g SDS，加入双蒸水并定容至100 ml，搅拌过夜，置于室温防止析出。（6）10% APS称取0.2 g APS，加蒸馏水2 ml，-20°C保存。（7）电泳缓冲液 (Running Buffer，5 ´)Tris 15 gSDS 5

4、gGlycine 72 g 调节pH 8.3，定容至1 L临用时用双蒸水稀释成1×，可重复使用3-4次（可根据电泳的速度决定下次是否使用）。（8）转移缓冲液 (Transfer Buffer，5 ´ )Tris 15.15 gGlycine 72 gSDS 2.5 g调节pH 8.18.5，定容至1 L，临用时双蒸水稀释，800 ml 1×的转移缓冲液加200 ml甲醇（9）TBST缓冲液（10×）Tris·HCl (pH 7.6) 30.28 gNaCl 80.15 g Tween-20 10 ml 定容至1 L，临用时双蒸水稀释成1

5、5;，可重复使用2-3次。（10）封闭液10.5 mg BSA溶于10 ml 1´ TBST中，搅拌均匀。（11）封闭液2 10 g 脱脂奶粉溶于 100 ml的1×TBST（12）叠氮钠存储液（13）一抗稀释液4上样前准备：（1）稀释样本 确定要加的每孔样本体积（ml）及上样量（mg） 计算样本需要稀释的终浓度 确定每个样本需要稀释的总体积（ml），4×上样缓冲液的体积为 总体积/4（ml） 根据已经测定好的蛋白浓度计算需要的蛋白量（ml） 总体积蛋白量4×上样缓冲液需要加的ddH2O 以下表为例样本编号蛋白浓度样本量4×sampleddH2

6、O体积终浓度加样量加样本量（ug/ul）mlmlmlml（mg/ul）mlmgA15.03 14.91 7.57.59 302.50 1230A26.62 6.04 45.96 162.50 1230A33.69 10.83 41.17 162.50 1230A44.33 9.24 42.76 162.50 1230A53.50 11.42 40.58 162.50 1230A65.46 7.33 44.67 162.50 12304实验步骤：（1）制胶及安装：按照如下方式安装，安装好之后用水加满以检验是否安装正确。（2）做胶及安装：将水倒干净，按照配方配置一定量的分离胶溶液（8ml）和浓缩胶

7、溶液（5ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。静止放置40-60分钟使凝胶聚合，按照如下方法放入电泳槽中（图中未插入梳子）。安装好制胶模具（根据厂家说明书安装）ß按下表配方灌制分离胶(Separating Gel)，分离胶浓度视目的蛋白的大小确定（7.5 - 15 %）（为两块胶用量）7.5 %10 %1

8、2 %12.5 %15 %DdH2O3.83 ml3.2 ml3.35 ml2.4 ml1.83 ml30 %丙烯酰胺2 ml2.64 ml4 ml3.36 ml4 ml1.5 M Tris-HCl pH < 8.82 ml2 ml2.5 ml2 ml2 ml10 % SDS80 ml80 ml100 ml80 ml80 ml10 % APS80 ml8050 ml80 ml80 mlTEMED8 ml8 ml5 ml8 ml8 ml总体积8 ml8 ml108 ml8 mlß分离胶上覆盖去离子水或0.1%SDS，使分离胶与空气隔绝ß待分离胶聚合后弃上层水相，用去离子

9、水洗，吸水纸吸干ß按下表配方灌制浓缩胶（Stacking Gel）4 46%ddH2O3.05 ml4.8 ml2.5530 %丙烯酰胺0.67 ml1.064 ml1.20.5 M Tris-HCl pH 6.81.25 ml2 ml1.2510 % SDS50 ml80 ml5010 % APS50 ml80 ml50TEMED5 ml16 ml5总体积5 ml（两块胶）8 ml（四块胶）5然后马上插上10孔或15孔梳子，待浓缩胶聚合后，小心拔掉梳子ß蛋白样本在100煮35 min使蛋白完全变性，用台式离心机稍离心ß把凝胶装在电泳装置上，内外槽均加入1

10、0;running buffer，然后加样加样顺序应该根据实验设计，以有利于论文发表的顺利，并记录加样的编号如：marker、A1、A2、A3、A4、A5、A6加的样本尽可能在中间，两边如有加样孔多余，可加1×上样缓冲液，以减少跑胶边缘效应ß100V电泳直到溴酚蓝条带到分离胶底部ß剪下一块与凝胶同样大小的硝酸纤维素膜（大小可根据经验），放在transfer buffer中平衡在硝酸纤维素膜右上角以圆珠笔做一个标记（如“1”、“2”表示不同的胶）ß卸胶（小心，防止胶的破碎及玻片的损伤），以硝酸纤维素膜外面的纸做标记将胶修切成一样大小在胶的左上角（加样开始的

11、那端）切一个小口标记方向（不能影响样本）ß把胶放在transfer buffer中平衡片刻ß取一容器，容器中倒入一定量的transfer buffer，在容器中安置好转移装置，在阴极面（黑色面）放上泡沫垫，然后放三层滤纸，把凝胶放在滤纸上，硝酸纤维素膜盖在凝胶上，然后依次放好三层滤纸，泡沫垫，扣好转移装置，加入冷却冰盒后开始转膜操作。转膜可采用恒流，常用200300mA，一般时间约为60-120分钟（根据目标蛋白的分子量大小而决定电压及时间）。也可以进行预实验，转膜一定时间后以考马斯亮兰染色胶，观察是否有残留的样本。所有的层面之间必须保证没有气泡，胶和膜必须完全吻合胶左上角

12、的小切口与膜右上角的标记应对在一起ß转膜结束后，取出硝酸纤维素膜或PVDF膜，在1´TBST缓冲液中短暂漂洗ß放入封闭液中，温和振荡30-60分钟ß把膜放入第一抗体中，温和振荡30分钟后放入4冰箱过夜或室温下反应2小时ß回收第一抗体，在TBST中洗膜30分钟，中间更换TBST 23次ß把膜置于第二抗体（HRP标记）中，温和振荡12小时ß在TBST中洗膜23小时，中间更换4次以上ß依据膜的大小，取一定量的ECL溶液A液和B液，将膜在溶液中准确温浴1分钟ß沥干膜，用保鲜膜包裹后，置暗盒中，曝光2秒60分钟&#

13、223;显影，定影或者 （这两块请补充细化）把膜置于第二抗体（荧光标记）中，温和振荡12小时ß在TBST中洗膜23小时，中间更换4次以上5数据分析：X光片用扫描仪扫描，然后用MetaMorph软件读integrated OD值6注意点：（1）在使用4×sample buffer时，应使缓冲液充分融解再使用，不能有沉淀；（2）建议蛋白样品小份分装，用一次取一份，避免反复冻融和煮样品，如需第二次使用已用过的样本，应同样用100水煮，时间为1min；（3）加样时每块胶应有相应的蛋白分子量标准和对照，并保持对照的始终一致。在抗原非常熟悉以后，可以适当减少蛋白分子量标准的使用以降低成

14、本；（4）加running buffer时内外槽不能贯通；（5）做电转移时，泡沫垫、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜之间不能留有气泡，每加一层都要赶气泡。（6）第一次做电转移，对于转移时间不能确定时，可将转移后的胶进行考马斯亮兰染色，如染不出蛋白条带，说明转移已完全，否则需延长转移时间；（7）膜与胶的大小必须一样，否则影响转移效率；（8）所有反应时间应根据温度的高低适当调整；（9）曝光及显影的时间可根据条带及背景的情况适当调整；（10）第二抗体反应以后洗膜一定要彻底。（11）在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。（12）过硫酸铵和TEMED的量应

15、根据室温和聚合情况而定。（13）分离胶聚合后最好在4ºC放置12小时后再使用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。（这一步有争议，有人认为4ºC可以使SDS析出，影响分离结果）（14） 上样体积不要太多，否则会影响旁边泳道的最终结果。7问题与对策Western blot实验过程比较简单，但在整个实验过程可以受到多个环节的影响，导致没有结果或者条带较弱，也可以出现背景过高，影响结果分析，我在此抛砖引玉，希望大家能够根据自己的经验对我的内容进行补充，以便于大家都能做好，但最重要的是做每一步实验时都要非常仔细。（1）没有条带或者条带弱： 蛋白样本：ü 蛋白在提取可能被

16、降解：此时可以在胶上负载不同浓度的样本，跑胶后以考马斯亮兰染色，正常时条带很多，呈现梯子一样的条带，如果蛋白被降解，阶梯状条带不明显，并且可在条带上出现连续的片状（如扫把扫过）。ü 加样时漏出，加样不足：可请经验丰富的人加同样的样本作为对照。ü 目的蛋白表达过低，此时可用阳性对照样本，如脑内表达较低的目的蛋白可以寻找表达较高的组织用于对照。 转膜不完整：ü 在转膜过程中由于试剂或者转膜电流、时间等因素导致转膜不完整：可在转膜结束后对胶进行考马斯亮兰染色，观察是否有蛋白留在胶上。 一抗、二抗效价过低ü 由于一抗的效价过低导致没有结果，此时可检测一抗的效价，

17、将一抗以推荐浓度作为中间浓度，往高、低各稀释成不同的浓度，如1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:5000等，取稀释液10 ml直接滴在硝酸纤维素膜上，做好标记（如下图），等干燥后进行封闭®洗膜®二抗孵育®洗膜®显影。观察哪个浓度可以出现较好的显影，可取稍高的浓度用于实验。ü 由于二抗的效价过低导致没有结果，此时可检测二抗的效价，同上将二抗以推荐浓度作为中间浓度，往高、低各稀释成不同的浓度，如1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:5000等，取稀释液10 ml直接滴在硝酸纤维素膜上，做好标记，等干燥后进行洗膜

18、®显影。观察哪个浓度可以出现较好的显影，可取稍高的浓度用于实验。 ECL、显影液、定影液ü 如果怀疑ECL失效或者敏感性降低，可选择荧光显影进行比较；ü 如果怀疑显影液、定影液，可以进行GAPDH等在暗室内可肉眼看到明显荧光的目的蛋白进行排除。另外：ECL显影和荧光显影可以相互交叉进行，使结果更加漂亮。（2）背景过高： 蛋白加样量过高：此时可选择一个样本，加不同的蛋白量，如2、5、20、30、50 mg/孔，取一个合适的加样量。 一抗、二抗浓度过高，此时可以参考点膜的结果。 洗膜时间过短，可延长洗膜的时间。 封闭不够完全，可增加脱脂奶粉或者BSA的浓度，或者在脱脂奶粉与BSA之间重新选择，或者增加封闭的时间。 洗膜不均匀，尤其是在同一个容器内有多张膜时，容易叠加，相互影响，可以在洗膜时多做观察，以确保每张膜都洗得比较充分，或者分开在不同容器内洗膜。8主要参考文献：（1）Luo JH, Wang Y, Yasuda RP, Dunah AW, Wolfe BB. The majority of N-methyl-D-aspartate receptor complexes in adult rat cerebral cortex contain at least three different subunits