双孢蘑菇子实体采后褐变及相关生化变化研究

1、双孢蘑菇子实体采后褐变及相关生化变化研究中国食用菌2021,29(3):4851EDIBLEFUNG10FCHINACN53-1054/QISSN10038310双孢蘑菇子实体采后褐变及相关生化变化研究刘吟,李成华,吴关威,边银丙,黄文f1.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉430070;2.华中农业大学应用真菌研究所,湖北武汉430070)摘要:实验研究了双孢蘑菇子实体贮藏期间褐变与总酚含量,酶(PPO和POD)活性,复原糖含量,Vc含量等生化指标之间的关系.结果显示,贮藏期间双孢蘑菇子实体茵盖外表色度值持续减小,褐变程度加重,总酚和复原糖含量均呈先上升后下降的趋势,vc含量持续下降,PPO

2、活性在前5d逐渐增加而后下降,POD活性先增加然后随着褐变的发生逐渐下降,而后期大局部褐变发生时又有所增加.相关性分析显示褐变程度与色度值之间呈显着负相关,以色度三值来反映褐变程度可行;Vc含量的变化与色度,J值呈显着负相关.关键词:双孢蘑菇;生化指标;褐变中图分类号:$646.1+1文献标识码:A文章编号:10038310(2021)030048-04双孢蘑菇(Agaricusbisporus)又名白蘑菇,洋蘑菇,是世界上最重要的栽培食用菌之一,但其子实体在采后贮藏及加工过程中极易产生褐变,直接影响双孢蘑菇的感官品质和内在质量.大大降低了其商品价值,已成为影响双孢蘑菇鲜销的主要原因.褐变常伴

3、随多酚氧化酶(PPO),过氧化物酶(POD)等相关酶活性的变化,褐变程度与总酚含量,复原糖含量,Vc含量等密切相关,也会因采后组织衰老,冷害,热胁迫,机械损伤,病原微生物污染或其它逆境胁迫等而加速裂变ll1.双孢蘑菇采摘后.由于其活泼的后熟过程会引发许多生理生化变化.因此,深入了解双孢蘑菇采后贮藏期间生理生化的变化对于从理论上认识组织褐变机制,为寻找控制褐变的有效方法提供理论依据,具有重要的理论和现实意义.主要研究了双孢蘑菇子实体采后贮藏期间总酚含量,相关酶活性,复原糖,Vc等生化特性的动念变化,并对其与褐变的相关性进行分析,探索双孢蘑菇的褐变机理,为褐变控制提供理论依据.1材料与方法1.1材

4、料双孢蘑菇(第二潮菇):采白湖北省农业科学院,品种为Ag2796.双孢蘑菇于下午5时左有采后立即放于冰箱(2±1)预冷14h,次Et凌晨7点将双孢蘑菇进行分拣,挑选菇体完整,大小均一(菇盖直径为50l/ira60Him),颜色洁白,菇盖未开伞,无病虫害,无机械伤的双孢蘑菇进行试验.1.2实验方法1.2.1材料处理把符合要求的双孢蘑菇洗净晾干后装人40cmx30cm大小的塑料筐,用PE保鲜袋套筐但不封口,贮藏于低温f4+11qC的条件下,每天随机挑取6颗蘑菇观测贮藏期间其生化和褐变特征的变化.1.2.2子实体褐变程度和色度值的测定褐变程度根据吴振先删的方法进行感官鉴定.1级,子实体菌盖

5、外表无任何褐变;2级,褐变区域不超过菌盖外表的1/4;3级,褐变区域占菌盖外表的1/4到1/2;4级,褐变区域超过菌盖外表的1/2;5级,子实体菌盖表面完全褐变.采用UltraScanXE型色度测试仪,测量双孢蘑菇子实体菌盖外表的色度值,平行测定数次取平均值.用值表示.L一0为黑色,L一1o0为白色.值越大,表示颜色越白.褐变程度越轻.1.2.3总多酚含量的测定FolinCiocaiheu比色法,参见李静等的方法嘲,稍做改动.称取剪碎混匀的菇2g,用80mL水洗人100mL容量瓶中,1O0C沸水浴30min,冷却,定容,过滤.滤液稀释适当倍数后,取1.0mL分别加人水5.0mL,FC显色剂(自

6、制)1mL和7.5%碳酸钠溶液3mL,显色.放置2h后.在760llm波长下测定样品的吸光度,再根据标准曲线计算样品中总多酚含量.1.2.4相关酶活性的测定工程来源:国家现代农业产业技术体系课题组,子课题"食用菌标准化平安生产技术体系建立与标准"作者简介:刘吟.硕士研究生.主要从事食用菌的保鲜技术研究通讯作者:E-mail:huangwen027yahoo.oom 收稿日期:20210322第29卷第3期刘吟等:双孢蘑菇子实体采后褐变及相关生化变化研究49(1)PPO活力的测定多酚氧化酶(PPO)活力的测定方法,稍做改动.称取剪碎混匀的菇1.0g,少许石英砂,7.0mL预冷

7、过的50mmol?LpH7.0的磷酸缓冲溶液PBS(内含1%聚乙烯吡咯烷酮),冰浴研磨,低温离心15min(24,10000r?min),上清液为酶提取液.比色杯中参加0.1mol?L一邻苯二酚溶液0.4mL及醋酸缓冲液(pH5.0)2.5mL,于250C水浴中恒温加热10min,参加0.5mL酶提取液.用磷酸缓冲液代替酶液做空白对照.410nm波长下测定其吸光值(A),每隔30S读数1次,共读3min.以吸光值对时间做图,取反响最初的直线局部,1个活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟引起吸光值改变0.01所需的酶量.(2)POD活力的测定愈创木酚氧化法51.称取剪碎混匀的菇5.0g.少许石

8、英砂,5.0mL预冷过的0.1mol?LpH5.5乙酸一乙酸钠缓冲液(内含4%聚乙烯吡咯烷酮),冰浴研磨,低温离心(10000r?rain,4)30rain,上清液为酶提取液.比色皿中顺序参加25mmo?L愈创木酚3mL,上述酶提取液0.5mL,0.5mol?LH2O2溶液200ILL,迅速混匀并同时立即计时,在反响15S时开始记录470nm吸光值,作为初始值,每隔30S记录1次,连续记录6min,以灭活的酶液作为参比.以吸光值对时间做图,取反响最初的直线部分,1个活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟引起吸光值改变0.01所需的酶量.1.2.5复原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)

9、法l5I.1.2.6Vc含量的测定紫外快速测定法问,称取剪碎混匀的菇5.0g,参加5mL1%盐酸匀浆,转移至25mL容量瓶中,稀释定容.离心(10000r?rain)10min后,取0.2mL上清液,参加盛有0.2roLl0%盐酸的10mL容量瓶中,定容后以蒸馏水为空白,在243nm处测定吸光值.根据标准曲线,计算Vc含量.1.3数据处理所有实验均重复3次,并取平均值用于分析.数据均采用EXCEL2003及其相关方法进行处理和分析,使用统计软件SASV8进行显着性及相关性分析.2结果与分析2.1双孢蘑菇贮藏期间子实体菌盖外表褐变程度和色度值的变化通过观测双孢蘑菇贮藏期间子实体菌盖外表褐变程度和

10、色度值的变化情况(见图1),分析两者间的对应关系,来探讨将双孢蘑菇褐变程度数量化的可行性.由图1可知.贮藏1d后,双孢蘑菇子实体菌盖外表褐变开始发生.并且随着贮藏期延长褐变程度逐渐加重.褐变区域面积逐渐扩大,4d后褐变速度加剧,同时值也由最初的86.75降至贮藏末期的77.76.褐变程度与色度值之间呈显着负线性相关(P<0.01),回归方程为一贮藏时fHJ/d褐变程度图1双孢蘑菇贮藏期间子实体菌盖外表褐变程度和色度值的变化2.2077X+89.346,R2=0.9603.因此,通过测量双孢蘑菇子实体外表的色度值,来反映其褐变程度是可行的.2.2双孢蘑菇贮藏期间子实体总酚含量的变化

11、褐变现象主要是由多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质而引起的.罗晓芳等嘲研究发现,果实内总酚含量与其褐变密切相关.为了探讨双孢蘑菇子实体内总酚含量是否也与其褐变相关,观测了双孢蘑菇贮藏期间子实体总酚含量的变化情况,见图2.【i缸寄贮藏时间,d图2双孢蘑菇贮藏期间子实体总酚含量的变化由图2可知,双孢蘑菇子实体中的总酚含量很高,达到895.8g?g-iFW,高于慈菇l1_,莲藕嘲,山药【l01,甘薯1】等大多数根茎类蔬菜.较高的酚含量赋予双孢蘑菇较强的褐变潜力.贮藏初期双孢蘑菇组织中总酚含量逐渐上升,于第4天到达最大值1219.4g?g-iFW,这可能是由于采摘造成的机械损伤引起受伤组织周围的细胞产生

12、更多酚类,增加的酚类物质可参与组织的伤愈过程,这一结果与许多以其他蔬菜为试材报道的研究结果一致".之后随着贮藏时间进一步延长.总酚含量又快速减少,6d后下降速度减慢,至贮藏结束时的第7天降为482.8Ixg?g-1FW.贮藏后种瑚咖湖咖伽瑚050中国食用菌EDIBLEFUNGIOFCHINAVo】.29No.3期,双孢蘑菇水分散失,膜脂过氧化作用加剧,导致细胞膜破坏,使本来被隔离的酚类底物与酶类结合,反响,造成酚类含量的减少.褐变明显.由图l和图2比拟可知,酚类物质的明显减少与褐变速度加剧均出现在4d后,时间相吻合,且随着褐变程度的加深.总酚含量也逐渐减少.因此,可以认为双孢蘑菇贮藏

13、期间酚类物质的减少是由于其被氧化成黑色物质导致褐变所致,这与陶菲【21的博士论文报道也相一致.2.3双孢蘑菇贮藏期间相关酶活性的变化2.3.1双孢蘑菇贮藏期间PPO活性的变化多酚氧化酶(PPO)是双孢蘑菇中存在的一类含铜的末端氧化酶.一般认为,采摘前果蔬体内PPO主要存在于完整细胞的质体(包括叶绿体,有色体和白色体)和微体中,而PPO的底物存在于液泡中,处于潜伏状态,通过一系列膜系统使两者区域化分布.而采摘后由于衰老或其它一些不良环境条件因素,可引起果实中正常膜结构的破坏而造成酚类物质与PPO结合,导致组织褐变.通过双孢蘑菇贮藏期I葡PPO活性的变化情况(图3),来推测双孢蘑菇采后子实体内PP

14、O活性与其褐变的相关性.臣已螺07贮藏时J司,d图3双孢蘑菇贮藏期间PPO活性的变化由图3可知,双孢蘑菇贮藏前期子实体的PPO活性逐渐升高.第5天到达最高值119.1U?g-tFW左右.对这段贮藏期间色度值与PPO活性相关性进行分析,结果显示两者呈线性负相关.相关系数为一0.90459.这与国内外许多学者对荔枝131,马铃薯,莲藕等果蔬中PPO参与酶促褐变反响研究的结论是相似的.贮藏5d后,PPO活性水平开始下降,这可能与褐变组织中减少的酶反响底物或者积累较高的褐变产物有关.2-3.2双孢蘑菇贮藏期间POD活性的变化过氧化物酶(POD)是植物体内抵御活性氧伤害的重要酶类.POD对减少活性氧积累

15、,抵御膜脂过氧化和维护膜结构的完整性有重要作用Il2J.另外,也有报道指出POD在H:O:存在下能催化酚类,类黄酮的氧化和聚合,导致组织褐变.通过研究双孢蘑菇贮藏期间POD活性的变化情况(图4),对双孢蘑菇子实体内POD的作用机制进行初步推测.由图4可以看出,采后1d,POD活性快速增加,可以认为是采后逆境的胁迫所致,诱发细胞产生POD来抵御活性氧的伤害.之后随着褐变的发生,POD活性降低,姆0023贮藏时间/d图4双孢蘑菇贮藏期间POD活性的变化但当贮藏后期出现大局部褐变时,POD活性又有所增加,可以推测出POD可催化某些酚类物质的氧化,参与了双孢蘑菇的褐变过程.这与吴振先【报道的荔枝果皮P

16、OD活性的变化,及杜传来l1_报道的鲜切慈菇POD活性的变化特点相类似.2.4双孢蘑菇贮藏期间复原糖含量的变化羰氨褐变是非酶褐变的重要途径,复原糖作为羰氨反应的直接反响物,其含量的变化对非酶促褐变有较大影响.复原糖是呼吸基质,其含量的变化大小也反映了生理生化的代谢强弱及采后腐烂的程度.因此,研究了双孢蘑菇贮藏期间复原糖含量的变化情况(见图5),以期寻找双孢蘑菇子实体采后褐变中是否存在非酶促褐变的可能.卿抽絮贮藏时间/d图5双孢蘑菇贮藏期间复原糖含量的变化由图5可以看,贮藏初期复原糖含量呈增加趋势,这与Hammandt61等对双孢蘑菇采后组分变化的研究结果基本一致.推测是菇体为了满足采后机体呼吸

17、代谢的需要而不断合成而来的,可能真正进入五碳糖磷酸途径的很少,因而导致复原糖的积累.而此时较高含量的复原糖可能又促使双孢蘑菇发生羰氨非酶促褐变或其他代谢,贮藏4d后随着褐变的发生复原糖不断转化而表现为逐渐下降.这一结果与王耀松口71报道的蟹味菇采后复原糖含量变化情况相类似.但确实的作用机制还需进一步研究.2.5双孢蘑菇贮藏期间Vc含量的变化果蔬在贮存过程中发生褐变,抗坏血酸含量会随之发生变化.一般认为,Vc自动氧化后生成含双羰基化合物,能进一步发生变化,聚合等形成有色物质.氨基酸,蛋白质等含氮物与变化了的Vc又能够发生化学反响从而大大加速褐变.这种反响可能是因为Vc与氨基酸之间发生了如如舳伯0

18、第29卷第3期刘吟等:双孢蘑菇子实体采后褐变及相关生化变化研究51羰氨反响所致I.但是,双孢蘑菇子实体采后是否存在这种形式的褐变反响还未见报道,因此研究了双孢蘑菇贮藏期间Vc含量的变化情况如图6所示.'bi缸U?贮藏时间,d图6双孢蘑菇贮藏期间Vc含量的变化图6显示双孢蘑菇贮藏期间Vc含量持续下降.贮藏结束时仅为开始贮藏时的39.5%.相关性分析结果显示.Vc含量与色度,J值呈显着负相关(P<0.05),说明Vc氧化等引起的非酶褐变可能也是造成双孢蘑菇褐变的重要因素之一.3讨论3.1双孢蘑菇褐变程度数量化目前,文献报道中关于双孢蘑菇褐变程度的描述主要有3种方式:感官鉴定,

19、根据分级标准进行判断,这种方法可能会受到鉴定者的个体差异以及光线的影响:褐变度测定,提取蘑菇中的褐色物质,在一定波长下测定吸光度值,这种方法会破坏样品的完整性,且消耗较多的人力和物力;色度仪测定,测定蘑菇菌盖外表的白度值,根据Gormley的分类标准,白度值85为好品质菇,在8085之间为可接受品质菇来判断,这种方法迅速,准确,方便.目前利用色度仪来研究果蔬褐变程度已有很多报道,但有关双孢蘑菇利用色度仪测定的白度值与感官鉴定的褐变程度是否有显着的相关性,两者是如何对应的还未见报道.实验结果说明,通过测量双孢蘑菇子实体外表的色度值,来反映其褐变程度是可行的,两者呈显着负相关关系<O

20、.01).3.2双孢蘑菇的褐变双孢蘑菇采后贮藏期间的研究结果显示,与酶促褐变有关的主要生化指标,酚类底物,PPO,POD酶活性变化与褐变密切相关.酚类物质的明显减少与褐变速度加剧的时间点吻合,且随着褐变程度的加深,总酚含量也逐渐减少,而PPO和POD共同作用影响褐变;与非酶促褐变有关的主要生化指标一复原糖和Vc含量的动态变化情况也与褐变的发生存在一定的关系,其中Vc含量与色度三值变化显着相关,说明双孢蘑菇中可能有非酶促褐变存在.需要指出的是,通过研究这些指标的动态变化情况.仅能表征随着褐变的发生这些指标是如何变化的,但并不能确定这些指标一定能直接作用于褐变及如何作用于褐变.目前的研究结果仅能提

21、供局部理论依据及一些推测分析双孢蘑菇贮藏中的褐变可能不仅与酚类底物,PPO和POD活性,复原糖和Vc含量等指标的变化有关,还可能与呼吸强度,苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,超氧化物歧化酶(SOD)活性,蛋白质含量及水分含量等指标的变化有关.本实验仅对双孢蘑菇采后局部指标的动态变化情况及其与褐变的关系进行了推测性分析,而其它与褐变有关的生理生化变化,及其之间的作用机理尚有待进一步研究【参考文献】【1】杜传来.鲜切慈菇贮藏中褐变的相关生理生化变化及酶促褐变机理的研究D.南京农业大学硕士学位论文,2006.【2吴振先.荔枝果皮褐变程度的数学模型研究【JJ.果树,2006,23f51:695-698.3李静,聂继云.Folin-Ciocaheus法测定葡萄和葡萄酒中的总多酚J.中国南方果树,2007,6(36):8687.【4J李宁,郁志芳,赵友兴,等.莲藕多酚氧化酶的酶学特性fJ.江苏农业,2002,18(1):6364.5李合生.植物生理生化实验原理和技术M.北京:高等教育出版社.2007.【6】赵连俊.水果中维生素C含量测定的研究JJ.当代化工,2021(6):672-673.7】董树剐,吴以平.植