氟西汀的手性拆分及机理研究

1、氟西汀的手性拆分及机理研究 浙江工业大学硕士学位论文氟西汀的手性拆分及机理研究姓名:姜薇申请学位级别:硕士专业:药物分析学指导教师:施介华201204浙江工业大学硕士学位论文氟西汀的手性拆分及机理研究摘要添加剂和纤维素.三.甲基苯基氨基甲酸酯】手性固定相拆分氟西汀对映异构体,并改变有机修饰剂、流动相添加剂、温度等实验条件考察其对分离效果的影响。通过计算对手性拆分过程中的热力学参数,成功地解释了.环糊精和纤维素一甲基苯基氨基甲酸酯】对氟西西汀的手性识别机制。在反相实验条件中,调节有甲醇比例、棚缓冲盐含量、值、环糊精浓度和温度等实验条件,观察氟西汀保留时间和选择性因子的改变。通过实验发现:甲醇比例

2、,/缓冲盐含量,值和温度越低,保留时间纭越久:而环糊精浓度增高则有利于对映体的出峰时间加快。在正相实验条件中,调节异丙醇与正己烷比例、二乙胺含量和温度等实验条件,观察氟西汀保留时间和选择性因子的改变。通过实验发现:异丙醇比例越低,温度越低,则越有利于保留时间珞的延长,分离度职增大。此外,通过温度实验条件的改变,可以得出氟西汀与纤维素衍生物之间的相互作用是焓驱动过程,且通过与/的浙江工业大学硕士学位论文曲线,可得出相互作用过程中的日,再通过比较两者的衄差,结果显示相较于砷一氟西汀,一氟西汀与纤维素一甲基苯基氨基甲酸酯】手性固定相结合地更为紧密。在手性识别机理研究方面,首先使用自动对接方法模拟氟西

3、汀对映体与.环糊精的包结过程,结果中选择最高簇中能量更稳定。再使用分层计算对自动对接得到的优势构象进一步精确优化。比较两者构象发现,相对于.氟西汀,氟西汀的手性碳原子更接近.环糊精的平面以及手性碳原子。在此基础上,还使用自然键轨道分析进一步研究主客体之间的相互作用。结果显示在.环糊精对氟西汀的手性识别过程中,氢键作用和超共轭效应起到了主要作用。关键词:氟西汀对映体,一环糊精,纤维素甲基苯基氨基甲酸酯】,浙江工业大学硕士学位论文匝住 一?刚./ ., 一, / .:,., . . 四一/一/?.一/ .木. .浙江工业大学硕士学位论文/一. ,【一?/一 . /? 【诵也 , . /一.,. /

4、? .:,【一 ,浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论.手性研究背景.手性药物分离的意义手性药物 ,是指因药物分子含有手性中心,而呈现对映异构现象的药物。在理化性质方面,最显著的特点就是它们的旋光性有所差别,分别被命名为型右旋或一型左旋。与此同时,随着不断的研究发现,人们开始意识到手性药物在生物体内所表现出的药效、代谢途径及毒副作用也存在着显著的差异。上个世纪年代的“反应停”事件,更是给人们敲响了警钟,所以药物研制过程中,进行严格的生物活性和毒性试验显得十分重要。随着研究的深入,人们发现手性药物在人体内的药理、代谢过程、毒性和疗效有以下几个显著差异:两种对映体的药理活性可相互协同,药理活性互补,

5、联合应用可起到很好的疗效】;对映体药理活性不同,可开发成种药物;两种对映体一种有治疗药理活性,而另一种却产生毒副作用【】;对映体两者之间具有相反的活性;一个对映体具有显著的活性但另一个对映体活性很低或无活性嘲;两种对映体有相同或相类似的药理活性,但作用强度有差异【。因此,在此情况下也刺激了手性药物市场的发展,而产生了巨大的经济价值。目前世界上使用的药物总数约为种,其中手性药物占%以上,在临床常用的种药物中,手性药物多达种。全球年以单一光学异构体形式出售的市场额达到亿美元,相比于年的亿美元增长了%以上【。.手性拆分方法概况与此同时,市场的需求也刺激了相关理论知识的深入研究和科学技术浙江工业大学硕

6、士学位论文的飞速发展,针对单一手性化合物的获得方法层出不穷,主要可以分为三大类:一类为手性源合成法【】指在手性原料的基础上合成手性物质;另一类为不对称催化合成法【,指在手性药物的合成过程中通过添加催化剂或酶来得到过量的单一对映体化合物的方法;还有一类就是指外消旋体拆分法,指通过手性剂的作用,利用物理化学或生物方法将外消旋体拆进行手性分离的方法【】。而因为其经济方便的特点,外消旋体拆分法在手性药物的拆分中正得到越来越多的应用。目前,针对手性药物的外消旋体拆分法主要又可以分为两种【:一种是非色谱法,包括结晶法、化学拆分法、动力学拆分法、手性选择性膜分离法、手性萃取法、手性选择性蒸馏与泡沫浮选法、生

7、物转化不对称法和传感器法等;另一类为色谱法,包括气相色谱法 ,、薄层色谱法谱 ,、高效液相色谱法、超临界流体色谱法,、毛细管电泳 ,等。由于快速、便捷、分离效果好等特点,高效液相色谱法已成为对映体分离研究中最为常用的方法之一。依据在手性分离中对样品前处理的方式,法拆分手性化合物对映体又可分为间接拆分法和直接拆分法两种。前者主要是手性试剂衍生化法 ,简称,利用手性化合物对映体混合物在预处理中进行柱前衍生生成一对非对映异构体,根据它们在理化性质上的差别,然后以常规固定相或手性方法达到分离的目的。在具有检测灵敏度高、分离条件简单、分离效果好等优点的同时,间接法也暴露出如手性药物需要有被衍生化的基团,

8、需要有高光学纯度的手性试剂,对各对映体衍生化速率和平衡常数应一致,衍生化和色谱过程中不能发生消旋化等缺点。因此,手性药物对映体分离最常用的是直接法,其工作原理通过待拆分对映体与手性剂之间的瞬间可逆相互作用,根据形成的缔合物的难易程度和稳定程度,对映体分离达到拆分的效果【】。根据手性剂的存在形式,它可分为两大类:手性流动相添加剂法,和手性固定相法,。手性流动相添加剂法是在流动相中加入手性添加剂,然后通过正相或浙江工业大学硕士学位论文是反相非手性固定相对对映体进行拆分。该方法有以下几种类型:通过加入如环糊精和手性冠醚等添加剂的手性包含复合法;通过加入如手性金属配合剂的手性配合交换法;通过加入反离子

9、添加剂的手性离子对色谱法等。其中环糊精及其衍生物因具有有大量的手性中心以及其“内疏水,外亲水”的独特结构,已经成为手性分离中应用最多的一种手性试剂【】。环糊精,为环状低聚糖,由.糖苷键连接成环,通常含有.个.吡喃葡萄糖单元,最常见的为包含、个葡萄糖单元的分子,分别称之为静、.和巧】,其结构参数如表?所示姗。表.的分子结构参数与?相比,的空腔大小适中,能与大部分对映体分子相匹配;而与相比,生产成本低、易得到。因此在种天然一、一和中,.的应用最为广泛,图?为含有个葡萄糖单元的结构示意图。图?的结构。姗 .浙江工业大学硕士学位论文根据图.,.环糊精的小端口的位上连接了个伯羟基,而大端口的、位上连接了

10、个仲羟基,其中位上的仲羟基指向环外侧的,而位上的仲羟基偏向环状空腔的中心轴方向,所以环糊精分子的外侧具有较强的亲水性。而在分子内侧,虽然在环糊精内腔的糖苷键上含有氧原子,但是由于它们处于空腔内侧和位上的氢原子屏蔽下,氧桥上的非成键电子对指向空腔内部,使内腔电子密度升高而呈强疏水性【。又因为每个组成环糊精的葡萄糖单元均含有个手性中心,因此,环糊精作为主体分子 ,具有含有大量的手性中心以及“内疏水,外亲水”的结构特点,在手性拆分过程中,可以与客体分子形成非对映体缔合物 ,从而实现对对映体的手性识别。手性固定相法是将手性化合物键合到固定相上,与手性药物对映体形成非对映体对复合物,然后根据其稳定常数的

11、不同进行直接拆分的方法。该方法有以下几种类型:型手性固定相刷型固定相 ;多糖类衍生物手性固定相 ;冠醚类手性固定相;环糊精类手性固定相 ;配体交换型手性固定相;大环抗生素类手性固定相 ;分子印迹手性固定相;蛋白质类手性固定相;聚合物类手性固定相 ;其他手性固定相如,核酸类手性固定相、和富勒烯类手性固定相、寡糖手性固定相等等。纤维素是由.吡喃葡萄糖通过,.糖苷键连接而成的线状聚合物,由于具有天然光学活性以及葡萄糖单元上的羟基易被衍生化的特点,因此纤维素手性柱在外消旋体拆分中也得到了最广泛的应用。图纤维素的结构 .浙江工业大学硕士学位论文纤维素是由.吡喃葡萄糖通过,.糖苷键连接而成的线状聚合物【引

12、,且呈螺旋型空穴结构,结构如图.所示。此外,每个葡萄糖单元具有个手性碳原因而作为主子,故由个葡萄糖单元构成的纤维素分子将有个手性中心。体分子 能够提供客体分子 个良好而易得的手性环境。从拆分原理上看,纤维素对手性对映体的拆分是通过将客体分子插入两个或多个单元之间的手性空腔中,形成非对映包合物而达到拆分的目的【引。.氟西汀对映体的手性分离氟西汀作为一种抗抑郁药,尽管在临床上常以外消旋体形式存在但是型对映体为速效抗抑郁药而型异构体比型作用时间长倍,此外型还可用于预防偏头疼【】,因此关于氟西汀异构体的外消旋拆分报道层出不穷。.氟西汀背景介绍作为一种选择性再摄取抑制剂型的抗抑郁药,氟西汀名“百优解”或

13、“百忧解”,其结构如图.所示,在药物分子中存有一个手性碳,为手性药物,其药物作用机制主要在于通过抑制神经突触细胞对神经递质血清素的再吸收以增加细胞外可以和突触后受体结合的血清素水平而达到抗抑郁的作用。由于其疗效确切,毒副作用低,与其他受体几乎没有结合力,因而在临床方面使用广泛。图氟西汀的结构示意图仃.早在年全球医药评论公布的资料显示,在年世界销售额领先的药品名单中,由美莱售额从年的第位升至第位,市场份额从.%增至.%【。自浙江工业大学硕士学位论文年月,礼来公司对百优解氟西汀的专利到期,此后市场上出现了一大批氟西汀药物,如何在市场中脱颖而出是一个值得深思的问题。在这一方面,对氟西汀异构体进行手性

14、拆分不能不说是一个好的途径。.氟西汀对映体的手性分离研究现状根据已有文献报道,迄今为止关于氟西汀对映体的外消旋拆分的相关报道主要可以分为间接拆分和直接拆分两个方面。间接拆分,在色谱法中通常指药物对映体在预处理中进行柱前衍生生成一对非对映异构体,再根据它们在理化性质上的差异进行分离,分离过程一般在非手性柱上就可以进行。如,王铁杰等人使用一一氯甲酰甲基一甲基胺基一一硝基苯并一嗯一,一二唑对氟西汀进行衍生化并使用直链淀粉一,.甲苯基氨基甲酸酯手性固定相在反相色谱条件下手性拆分【】;郭兴杰等人一一氯甲酰甲基?一甲基胺基一?,二甲胺磺酰基苯并一嗯一,一二唑对氟西汀进行衍生化并且使用纤维素,一二甲苯基氨基

15、甲酸酯 分离氟西汀的荧光衍生物,并对分离机理进行了探讨拆分【】;.等人用以氟乙酰脯氨酰氯为衍生试剂对氟西汀进行衍生化并使用气相色谱法对其手性分离【】;邓金根等人以扁桃酸作为衍生试剂的化学提取法【】;等人用一一一卜萘基乙基异氰酸酯衍生试剂对氟西汀和其主要代谢物诺弗西汀进行衍生化并分离【】等。作为手性添加剂同时对美沙酮,氟西汀,文拉法辛,和曲马多四种手性药物主要代谢物诺弗西汀的手性分离效果【;等人分别在正相和反相实验条件下使用,一二甲基苯基氨基甲酸酯纤维素和卵类粘蛋白作为手性固定相对氟西汀手性拆分;等人在万古霉素手性固定相中对氟西汀和其主要代谢物诺弗西汀进行手性分离【】;等人比较对一甲基纤维素和,

16、一二甲基苯基氨基甲酸酯纤维素作为手性固定相时对氟西汀等咪唑类似物的手性精一为手性选择剂的双动态吸附毛细管电色谱同时拆分氟西汀和西替利嗪对映体【】;周婕等人在二甲基环糊精手性固定相上对氟西汀进行手性分离浙江工业大学硕士学位论文【;李桦等人考察了羧甲基一。环糊精?、环糊精.、羟丙基一.环糊精.、二甲基一.环糊精?.在毛细管电泳中对卡替诺尔和氟西汀对映体的分离效果【】;王志欣等人使用脲衍生物型手性固定相拆分氟西汀对映体【】;周婕使用全苯异氰酸酯化环糊精固定相对氟西汀异构体拆分。不难看出当前针对氟西汀对映体的拆分方法比较多,然而针对氟西汀拆分机理相关报道却是相当罕见,因而如何对其进行深入研究是一个值得

17、探讨的问题。.手性识别机理研究简介.手性识别机理研究方法近年来,除了关注对手性药物的分离条件的选择及优化,手性识别机理研究也开始引起了人们的关注。目前关于药物异构体手性识别机理的研究方法主要有以下三大类:色谱学研究【,指通过拆分实验现象对分离过程的手性识别机理进行初步推测。常用的有热力学分析法是指通过计算主一客体之间的热力学参数来研究分子间的相互作用。其中焓变么劢反映主客体间相互作用的大小,.熵变凹回反映主.客体分子间构象变化的程度【】。一般来说,日的绝对值越大,主一客体间相互作用越强,越有利于主.客体间相互作用的发生;而越大,主一客体间发生相互作用前后,构象变化的程度越高。年,黄碧云等人在高

18、效毛细管电泳中对苯磺酸氨氯地平对映体进行了手性分离【,并考察了温度等实验条件对分离效果的影响,通过对实验现象的比较以及热力学参数的计算,对手性药物在色谱柱中与手性选择剂的相互作用形式以及过程中焓和熵的变化有了初步的认识。光谱学研究?”,指通过各种物质所产生的光谱来判断物质之间的相互作用,从而了解原子、分子等的能级结构、能级寿命、电子的组态、分子的几何形状、化学键的性质、反应动力学等多方面物质结构的信息。包括核磁共振、红外光谱、荧光分析、射线衍射等方法。用前后吸收光谱的变化来推测主客体间相互作用的程度;核磁共振波谱则可通过原子的化学位移或是原子的吸收峰的变化等来判断是否形成包结物以及包结比;一射

19、线衍射分析法则是根据晶体形成的射线衍射,判断分子浙江工业大学硕士学位论文内原子的空间分布状况从而获得化合物存在的状态及原子间的相互结合方式】。年,沈漪等人尝试用红外光谱探讨苯甘氨酸外消旋体与色谱拆分三点作用原理之间的关系,根据苯甘氨酸单异构体和外消旋体在不同的波长处的吸收峰,表明三点作用原理可在红外谱中预测对映体的拆分机理】;年,王恩和举等人用 研究.环糊精对布洛芬对映体的手性识别机理【,的手性选择剂。计算机模拟研究。随着计算机技术的发展和分子力场理论研究的深入,可以在借助计算机辅助的前提条件下,通过建立分子模型,并且设置相关参数,模拟手性识别过程,从而在分子水平上阐述药物对映体的识别机理。年

20、,潘和蹇等人用分子动力学 ,和分子对接技术研究【、.和及它们的高磺化衍生对苯海索对映体的手性识别机理,结果证明范德华力为它们之间的主要结合力。.色谱分离过程中的热力学研究已知在经典热力学中体系自由能变化与焓变月、熵变之间的关系遵从方程:脯一黜.在色谱法分离光学异构体过程中,溶质的容量因子甸与柱温的关系和对 方程壤示:一等等足, 尺一百一螋?式中为溶质的容量因子,为选择性因子,为相比率,丁为柱温,为气体常数。在一定的温度范围内,对/和.厅作图可得 西曲线,从,曲线的斜率和截距可以分别求得色谱保留过程中的自由焓彳日及其差值彳功,熵值彳及其差值凹。日的绝对值越大,表明对映体与系统之间的作用力越强;的

21、绝对值越大,表明对映体与系统相互作用时的构象变化越大。浙江工业大学硕士学位论文彳彳劢反映对映异构体与系统之间作用力的差异,其绝对值越大,说明对映体与手性选择剂的作用点越多,作用迁移差越大;彳凹则反映对映异构体在两相中混乱度的不同,其绝对值越大,说明对映体与手性选择基团的作用过程中,两个对映体与手性选择基团的匹配性差别越大,越有利于两者间的分离。.计算机分子模拟研究介绍计算机模拟研究可以从原子水平解释对映体的手性识别机理,从而更直观地方面解释分子间的相互作用,因而近年来被越来越多的应用到手性识别机理研究中。主要方法可分为两种方式:一个是通过量子化学计算,另外一种方式就是采用分子力场计算。.量子化

22、学计算量子化学计算是应用量子力学的基本原理和方法研究化学问题的一种方法,主要研究原子、分子、凝聚态物质,以及原子核和基本粒子的结构、性质等。在分子模拟中最为常用的就是量子力学 ,方法。量子力学 ,根据量子力学原理,定态分子的能量和其他许多性质可用薛定谔方程来求解:/其中,日为哈密顿算符,是一个对应于能量的微分算符;为这一状态下的能量;、王,为波函数。处理分子问题的时候,通常分离电核子与电子之间的运动,将电子看作在与核的相对位置固定的场中运动,通过研究电子和原子核的空间位置及运动状态,从微观角度来计算分子结构、系统能量、分子轨道等相关参数。在已有的文献报道中最常用的方法有从头计算法 、半经验计算

23、法及密度泛函理论 ,。冻结近似和单电子近似轨道近似下,不再引进其他近似的条件,选择一组合适方法。由于从头算法得到的是直接可与实验比较的轨道能量和体系总能量,所以较高的计算精度,且可靠性也很大,但是消耗时间较多,对于一些复杂的分子体浙江工业大学硕士学位论文系难以处理。因此从头计算法目前还只是用于处理原子数目和电子数目较小的体系。是指在求解方程时,忽略一些积半经验计算法.分或在计算积分值时使用拟合的经验参数,这些方法虽然在理论上不够严谨,但如果仅用于计算分子的性质,并在此基础上研究结构与功能的关系,能够极大地提高效率,用于研究包含更多原子的系统。其中最为常用有和、 法等。计算作为半经验计算方法中的

24、一种,省略或近似处理了第一原理,也称为从头算方法计算中的一些项。为了修正这方法些近似方法带来的误差,半经验方法计算使用了一系列由实验结果拟合的参数。这种计算所得到的资料带有定性的和半定量的特性.实际上,如果该方法用于一些它力所能及的问题,计算结果的精确度通常足以说明所研究分子的性质,因而当前关于计算方法的使用报道举不胜举】。尽管在半经验方法中依据试验值对一些计算所进行的参数化补偿了计算方案的不足.但是,却不能苛求半经验方法面面俱到,使分子的各种电子性质的计算都有同样好的结果。密度泛函理论方法能够很好地解决这一点。密度泛函理论 ,作为一种研究多电子体系电子结构的量子力学方法,用电子密度取代经典方

25、法中的波函数做为研究的基本量。因为多电子波函数有个变量为电子数,每个电子包含三个空间变量,而电子密度仅是三个变量的函数,无论在概念上还是实际上都更方便处理。因此与从头计算法相比,该方法所能计算的体系更大;与半经验计算法相比,精度更高。.分子力场计算相对于采用量子力学计算的分子模拟,分子力场计算并不计算电子相互作用,它对分子结构采用一种简化模型。在这个模型中,它把组成分子的原子看成是由弹簧连接起来的球,然后用简单的数学函数来描述球与球之间的相互作用。换言之,分子的能量随分子构型的变化而变化,而描述这种分子能量和分子结构之间关系的就是分子力场函数。而相应的分子力场函数来自实验结浙江工业大学硕士学位

26、论文果的经验公式,在适当的范围内,其精确度能够满足计算的要求。当前,不同的科研团队设计了适用于不同体系的分子力场,而不同的分子力场具有原子类型,势函数,和力场参数,所以需要有所区别。当前,以分子力场为基础的分子力学计算方法在分子力学 ,、分子动力学,、蒙特卡罗方法 ,、分子对接等分子模拟方法中有着广泛的应用。分子力学 ,分子力学 ,是模拟分子行为的一种计算方法,假设其中每个化学键都有相应标注的键长和键角,分子要改变几何构象,必须使其键长值和键角值尽可能的接近标准值,同时也使非键作用能处于最小的状态【孙,超过这一定的标准都会引起相应的能量升高。其能量大小主要应用牛顿计算分子的势能来表示,通常可以

27、将势函数分解成键伸缩能、角弯曲能胁小二面角扭曲能,册。范德华作用能,咖和静电作用能。,。删。总能量可以表示为:悖一?怫口通过分子力学计算和能量优化,可以对化合物的空间结构加以确定【。常用的、等。分子力学软件有分子动力学 ,由于人们开始意识到分子动力学性质的重要性以及体系变化过程中自由能等热力学参数的意义,分子动力学,】作为建立在牛顿力学基础上的又一种分子模拟方式开始进入人们的视野。其工作原理为通过牛顿力学来模拟分子体系的运动,以在由分子体系的不同状态构成的系统中抽取样本,从而计算体系的构型积分,并以构型积分的结果为基础进一步计算体系的热力学量和其他宏观性质。其中所采用的模拟退火技术可以有效地寻

28、找分子的优势构象,既能考虑到能量下降的变化,也考虑到部分能量上升的构象,所以就有可能跳出局部,达到全局优化。此法的优点是取样恰当,对低能量的构象取样概率大,缺点则是计算量极大。蒙特卡罗.浙江工业大学硕士学位论文蒙特卡罗 ,是以概率和统计理论方法为基础的一种计算方法。进行分子模拟计算是按照以下步骤进行的:使用随机数发生器产生一个随机的分子构型;对此分子构型的其中粒子坐标做无规则的改变,产生一个新的分子构型;计算新的分子构型的能量;比较新的分子构型于改变前的分子构型的能量变化,判断是否接受该构型;如此进行迭代计算,直至最后搜索出低于所给能量条件的分子构型结束,目前已有蒙特卡罗程序,如、等。鉴于分子

29、动力学方法和蒙特卡罗法两者的特点,在实际应用中经常把两者联合使用。分子对接技术【年,.提出的“”和提出的“受体学说”认为大多数药物通过与体内某些特定分子结合发挥效应,这为分子对接方法奠定了理论基础。随后计算机和计算科学的迅速发展,又大大推动了分子对接研究的脚步。当前,分子对接的一般工作原理是将客体分子放在主体分子的活性位点处,通过不子间相互作用的最佳构象。根据对接过程中不同的简化程度,分子对接可以分为三种类型:刚性对接、半柔性对接以及柔性对接。刚性对接指在对接过程中,研究体系的构象不发生变化;半柔性对接指在对接过程中,研究体系尤其是配体的构象允许在一定范围内变化;柔性对接指在对接过程中,研究体

30、系的构象基本可以自由变化。当前,为了尽可能实现不同分子间的识别研究,新的分子对接方法层出不穷,包括、&、和等,其中最常用的分子对接软件为,据统计被引次数达%。如何找到最佳的结合位置以及如何评价分子间的结合强度是分子对接中首要解决的问题【 ,作为应用最广泛的对接软件,因采用拉马克遗传算法搜索对接构象且对接过程中采用半柔性对接,即过程中研究体系尤其是配体允许在一定的范围内变化,适于处理小分子和大分子之间的对接,能够较快地寻找到配体与受体之间的最佳结合位置。而在如何评价分子间的结合强度方面,采用半经验自由能评价函数凹作为评价标准对分子间的结合方式进行打分排序,其具体表达公式如下:浙江工业大学

31、硕士学位论文其中,前三项表示范德华作用力,氢键作用力和静电作用力。表示背离实际键长和键角的偏差;表示对分子内部的转动和分子整体旋转平移的限制;表示去溶剂化作用能,即分子与溶剂接触所引起的熵的变化,可反映溶剂效应【 。正越来越受到广泛的应用。.量子力学和分子力学相结合的方法/峨建立在分子力学基础上的分子力学方法四或是分子动力学方法仍,尽管可以较为准确地描述分子间的范德华作用力、氢键作用力等,但是却无法考虑电子的运动,而电子在键的形成、断裂和电荷转移中都起着重要的作用。另一方面,量子化学方法虽然可以能精确地预测各种中小分子性质,但由于耗时过长,在使用方面还受到一定的局限性。近年来兴起了量子力学与分

32、子力学相联用/,综合了两者的特点,用量子化学研究表面吸附活性位附近的电子运动,用分子力学讨论整个固体表面。在确保高精度的同时,又能保证高效率,已广泛应用到较大化学体系与生物体系研究中。.环糊精及其衍生物的手性识别机理以及研究现状.中已提到过,由于含有多手性中心和内疏水,外亲水的结构特点,环糊精及其衍生物是最常用于外消旋体拆分的手性选择剂之一。而在大量的文献报道关于使用环糊精及其衍生物对手性药物进行拆分的同时,关于两者之间的手性识别研究也引起了人们的关注。目前针对环糊精对对映体手性机理的解释主要有:主客体相互作用机理、缔合作用机理、构象诱导机理和包埋机理,它们分别从不同角度说明了环糊精分子中的多

33、手性中心和空穴结构在手性拆分中所起的重要作用【】。主客体相互作用机制,指客体分子通过空间匹配作用、范德华相互作用及疏水作用进入环糊精空腔形成部分或完全包结物;或是指通过氢键作用、偶极.偶极作用、静电作用等与客体分子在环糊精外侧形成复合物;包埋作用机制畔】,对映体和环糊精及其衍生物可以形成紧密的包合物,这种包合物既有可能是对小分子的完全包合也有可能是对大分子的部分包合,再根据对映体与环糊精包合紧密程度的差异而使它们分离,环糊精或是其衍生物分子浙江工业大学硕士学位论文的尺寸与对映体分子的体积及形状匹配程度是主要影响因素;构象诱导作用制【,当手性分子靠近环糊精时,两者的结构会做出相应的调整,从而使得

34、环糊精分子构象适合于客体分子而增强两者之间相互作用。同时,环糊精侧链的取代基团也会对此作用产生一定的影响。若在一定程度内,取代基团的纯在可增加环糊精分子的柔韧性,有利于两者之间的构象诱导作用;但如果取代基团较大,则有可能引起空间位阻增大,而诱导作用反而降低;缔合作用机制脚】,对映体分子与环糊精顶部、侧面或底部等外沿形成松散的、多点作用的缔合物称为缔合作用机制。例如,客体分子上具有冗电子给予体的苯环或是烷基苯可以与.环糊精侧链上的或是?发生?键形成缔合物。环糊精与手性分子主要是通过非共价键而产生相互作用,其中包括:静电作用力; 氢键作用力:范德华引力偶极一偶极作用力、色散力、诱导力; 疏水作用力

35、、阳离子一【作用等。静电作用,是化学键?离子键形成的本质,指阴、阳离子由于静电作用形成不带电性的化合物,包括静电引力和静电斥力;氢键作用,指氢原子与电负性的原子共价结合时,共用的电子对强烈地偏向的一边,使氢原子带有部分正电荷,能再与另一个电负性高而半径较小的原子结合,形成的?型的键【】;范德华力,又称分子间作用力,产生于分子与分子之间或高分子化合物分子内官能团之间的作用力,又可以分为三种作用力:诱导力、色散力和取向力偶极作用;疏水相互作用是非极性分子之间的一种弱的、非共价的相互作用,通过疏水物的疏水基于水相互排斥作用而发生的,在水相环境中具有避开水而相互聚集的倾向;阳离子一?作用,离子一;作用

36、是一种存在于阳离子和芳香性体系之间的相互作用,与一些经典的作用如氢键、静电和疏水相互作用相比,主要源自离子对间的库伦吸引力,被认为是一种新型分子间作用力,普遍存在于生物体系中】;因此,针对环糊精及其衍生物对手性药物的识别机理除了可以通过如浙江工业大学硕士学位论文体之间的包结比、结合常数、热力学参数以及在此基础上所推导出来的关于主.客体间发生相互作用的位置【引;也可以借助一射线衍射分析法或是计算机模拟技术从原子或是电子水平去研究分子子间的非共价键相互作用从而对主.客体分子间的手性识别机制有着更深入的理解。此外,还可以将宏观机制研究和微观机制研究结合起来。首先使用紫外一可见光谱、核磁共振波谱法、热

37、力学分析法等通过计算主客体间的包结比、稳定常数、熵焓补偿关系以及推测客体进入空腔的方向及位置等从宏观实验方面来研究分子间的相互作用;再使用一射线衍射分析法、分子模拟研究计算等通过阐述主.客体中分子、原子和电子能量、位置相关情况从微观结构方面研究分子间的相互作用,并对前者实验结果加以验证。.本论文的研究目的和内容.氟西汀对映体在不同实验条件下的手性拆分本论文以氟西汀对映体为拆分对象,分别考察了氟西汀对映体在正相条件和反相条件下的拆分情况。在正相实验条件中,以纤维素一一甲基苯基氨基甲酸酯作为手性固定相 ,对氟西汀进行了手性分离,并考察了温度、流动相比例和流动相添加剂含量对拆分效果的影响;在反相实验

38、条件中,以。作为手性流动相添加剂 ,对氟西汀进行了手性分离,并考察了环糊精含量、缓冲盐浓度和等实验条件对拆分效果的影响。使用分子对接技术模拟了氟西汀对映体与.的相互作用过程,并通过得到的手性药物与.之间的相互作用能的差值彳凹结合力学原理,解释了?对氟西汀对映体的手性分离机制,并详细阐述各分子力在其中所起到的作用;再通过分层计算使用混合基组对已获得的优势构象进一步精确优化,然后进行自然键轨道分析分析分子中各个轨道的详细情况。浙江工业大学硕士学位论文第二章一环糊精对氟西汀对映体的分离研究.前言作为一种选择性再摄取抑制剂型的抗抑郁药?氟西汀如图.,通常是以外消旋体给药。但研究表明,其构型和构型异构体

39、在体内代谢作用上存在着差异,其中型对映体为速效抗抑郁药而型异构体比型作用时间长倍,此外在临床药理方面,型还可用于预防偏头疼。在面对当前竞争激烈的市场,如果能提高药品的疗效或是开发出药品的新功能,无疑是一个好的方法,因而针对氟西汀的外消旋拆分具有重要意义。垂图?氟西汀的结构不恿图.?另一方面,自年发现环糊精以来,由于其具有多个手性碳原子及独特的笼状空穴结构,以及内疏水外亲水的结构特点,因而在分子识别应用中占有重要的地位。其中,与相比,如图的空腔大小适中,能够与大部分对映体分子相匹配;而与相比,生产成本低、易得到,因此及其衍生物更是被广泛应用于气相色谱、液相色谱】、毛细管电泳等领域的手性分离研究。

40、浙江工业大学硕士学位论文图?的结构。. ?.在氟西汀对映体的手性拆分研究中,及其衍生物也得到了大量地应等人在毛细管电泳中使用高磺化丫环糊精作为手性添用。如,加剂同时对美沙酮,氟西汀,文拉法辛,和曲马多四种手性药物进行分离【】;物诺弗西汀的手性分离效果【】;姜廷福等人了以海美溴铵为阳离子表面活性剂,并以磺化一.环糊精.?为手性选择剂的双动态吸附毛细管电色谱同时拆分氟西汀和西替利嗪对映体【】;周婕等人在二甲基环糊精手性固定相上对氟西汀进行手性分离【】;李桦等人考察了羧甲基一.环糊精.、.环糊精、羟丙基一一环糊精?、二甲基一环糊精?在毛细管电泳中对卡替诺尔和氟西汀对映体的分离效果【】;周婕使用全苯异

41、氰酸酯化环糊精固定相对氟西汀异构体拆分。多,但针对其具体的拆分机理研究通常是通过改变实验条件,再根据诸如容量因子,选择性因子,分离度等实验现象的变化,推测其分离机理,更为具体的文献倒并不多见。年,周婕等人通过测定静态吸附等温线,测定苯异氰酸酯基.环糊精对抗抑郁药氟西汀对跌体的吸附选择性,从而得出.氟西汀与苯异氰酸酯基环糊精的相互作用要比.氟西汀强【们。本次实验以一环糊精作为手性流动相添加剂对氟西汀对映体进行手性分离,并考察有机修饰剂比例、缓冲盐浓度、环糊精含量和温度等实验条件对.环糊精识别氟西汀对映体的影响。浙江工业大学硕士学位论文针对.环糊精对氟西汀对映体的手性识别机理研究,本实验采用计算机

42、模拟技术研究.环糊精对氟西汀对映体的手性识别机理。首先采用自动对接软件模拟:环糊精与氟西汀对映体的包结过程。然后,在对接结果中选择优势构象,并在此基础上对所得结果进一步精确优化。已知当体系较大时,不可能对所有原子均采用较大的基组,此时可对其中的局部原子采用精度较高的基组来描述,而对其余原子采用小基组来描述,应势而生。该方法不需用参数表示各个区域间的相互作用,而且减少了计算难度,因此理论近年来被广泛地应用于分子模拟研究【。本实验中正是采用分层计算法对氟西汀和环糊精所形成的包结物进行进一步精确优化,这样既提高了计算结果的精确度,又减小了计算成本。在此基础上,为了更好地解释/.在上手性识别机理,还采

43、用 方法探究主客体之间的作用力。又称自然键轨道分析方法,主要通过分析结构、电荷、键级、杂化、共振,电子给予体.受体相互作用等【】来表征分子中各个轨道的详细情况。.实验部分.试剂与仪器系列高效液相色谱仪,系列检测器以及相应的授权工作站色谱柱购买自沃特世公司位于美国马萨诸塞州的米尔福德;,.×流动相过滤器购买自长城玻璃仪器厂中国安徽;磷酸盐缓冲液样品,计;盐酸氟西汀对映体由浙江工业大学中国浙江药学院提供;甲醇为色谱纯;水为双重蒸馏水。.色谱条件组成流动相的基础溶剂为不同浓度、不同值的磷酸盐缓冲溶液,改性剂为甲醇。使用前用.岬滤膜过滤。紫外检测波长为进样量均为此。保留时间由溶剂峰判断得出。

44、.分离顺序的测定将消旋氟西汀盐酸盐. 分散于一定量的乙酸乙酯,并加入浙江工业大学硕士学位论文%碳酸钾 ,搅拌. 小时后分液,用乙酸乙酯洗涤水相,并合并有机相用饱和食盐水洗涤,再以无水硫酸钠干燥过夜,然后蒸除乙酸乙酯得消旋氟西汀甲苯中,加【。将外消旋氟西汀与.一扁桃酸低于. 混合于热至完全溶解,冷却析晶,抽滤,然后蒸除甲苯得.氟西汀【】,进样,测得.氟西汀先于.氟西汀出峰。.分子模型的构建及构象优化主体分子初始结构取自剑桥晶体数据库,采用软件去除水分子,再用 软件包中程序结构优化;客体分子氟西汀初始结构取自剑桥晶体数据库,先用软件包中的程序进行几何全优化,然后再将得到的初始结果使用密度泛函方法精

45、度优化,基组设为/烈,。.对接参数的设置将优化好的主客体分子使用.进行自动对接,选取做为对接受体,以其晶体结构为参考,加极性氢,选用电荷,并且. .【的受体去除所有水分子,选用大小为.格点盒子覆盖主体分子,其中格点间距为. ,中心确认为客体分子中心,选择均方根偏差. 作为评价标准进行聚集,对接结果为个,通过结合自由能的大小以及同类构象的簇的高低分子出现概率来选择对接结果中的最优构象。.结构优化再将所获得的最优构象使用分层计算进行进一步地优化。将/.的包结物划分为两个部分,其中内层的氟西汀分子使用高精度的计算方法?密度泛丞法,选用之前优化客体分子所采用的相同基组/?,;而外层豹主体分子?则使用半

46、经验计算方法。最后,再把从分层计算所得到的优化构象在采用密度泛函法/,基组的基础上进行自然键轨道分析计算,以充分了浙江工业大学硕士学位论文作用等分子间非共价键的详细信息。.结果与讨论.流动相比例的影响环糊精在识别对映体时,对映体疏水部分有选择地进入到疏水空腔中,亲水部分与开口处的羟基由于氢键作用,根据对映体异构体与形成络合常数不同的包合物以达到手性分离的目的。甲醇作为有机修饰剂,因为其存在相对疏水性,加入缓冲液中后会占据环糊精的部分疏水空腔,能改变包合物的形成常数,从而改变手性选择剂的浓度能对分离效果产生影响。表.所示,随着甲醇含量的升高,对映体保留时间啪降低,分离因子仅变化不大。.分别表示承

47、和一的保留时间; 勋,屯表示.和.的容量因子,其中呔一/;仅表示对映体的选择性因子,其中萨屯惭。色谱条件:./的.手性选择剂, /的/缓冲盐溶液,.,流速./柱温为。的实验条件下,测定流动相中甲醇含量对对映体的分离影响。.缓冲盐离子强度的影响磷酸二氢钾是最常用的缓冲盐之一,能跟环糊精外侧的羟基发生氢键作用,因而调节缓冲盐浓度能改变环糊精的手性识别能力。此外,磷酸二氢钾浓度增大,流动相的极性增强,又因盐酸氟西汀在此实验条件下以分子状态存在,从而使样品在系统中的保留时间延长。如表所示,缓冲盐浓度的降低,保留时泪缩短,分离因子变化不大。浙江工业大学硕士学位论文表缓冲盐离子强度对氟西汀对映体拆分的影响

48、 .幻,分别表示.和的保留时间; 白,幻表示艰和一的容量因子,其中七/;表示对映体的选择性因子,其中萨.色谱条件:./的手性选择剂,甲醇:缓冲溶液体积比:, .,流速./,柱温。的实验含量对对映体的分离影响。条件下,测定流动相中.流动相值的影响表.流动相值对盐酸氟西汀对映体手性拆分的影响. .而,幻表示和一的容量因子,分别表示和的保留时间;其中./;表示对映体的选择性因子,其中萨.色谱条件:./的?手性选择剂,甲醇:缓冲溶液体积比:, ./的/缓冲盐,流速./,柱温。的实验条件下,测定流动相中大小对对映体的分离影响。环糊精空穴呈疏水环境,因此缓冲盐并不能进入环糊精空腔性拆分效果。其值对盐酸氟西

49、汀对映体手性拆分的影响主要原因在于大小能够影响氟西汀分子/离子状态,从而影响了溶质的保留行为,进而对分离因子产生影响】。如表.所示,随着流动相值的增加,氟西汀对映体的保浙江工业大学硕士学位论文留时增加,分离因子基本不变。.含量的影响如表所示,随着含量的增加,氟西汀对映体的保留时间哟减少,分离因子变化不大。因随着.含量的增加,能与氟西汀对映体发生相互作用的手性选择剂增加,从而氟西汀包合进入.增多,则与固定相之间的相互作用减少,从而保留时间变少。表肛浓度对盐酸氟西汀异构体手性分离的影响. . .,如分别表示四一和的保留时间; ,也表示和一的容量因子,其中琅./;表示对映体的选择性因子,其中萨/。色谱条件:甲醇:缓冲溶液体积比:, .,流速./柱温./的/缓冲盐,。的实验条件下,测定流动相中.含量对对映体的分离影响。此外