PCR检测技术（三）

1、蓝色海洋书的海洋pcr检测技术（三） (1)运用化学手段对目标dna举行提取。(2)设计并合成引物，引物设计或合成的好坏挺直打算pcr扩增的成效。(3)举行pcr扩增。(4)克隆并筛选鉴定pcr产物，将扩增产物举行电泳、染色，在紫外光照耀下可见扩增特异区段的dna带，按照该带的不同即可鉴定不同的dna。(5)dna序列分析不同的对象，如扩增dna片段序列全知、半知或未知，其pcr参数、退火温度、时光和引物等都有较大的差别，部分更组合了rflp, sequence和反转录pcr等技术，形成了众多的衍生技术，如多重pcr、定量pcr、竞争pcr单链构型多态性pcr、巢式pcr等，这些技术使pcr在

2、食品中的应用潜力更广。(六)pcr反应的注重事项因为pcr反应敏捷度十分高，所以pcr反应中通常应注重下列事项：(1)预备自己的一套试剂，并少量分装贮藏在无菌工作台附近的专用冰箱内，这些试剂不要挪作他用。配制试剂时应用法未与试验室中其他dna接触的新玻璃器皿，塑料器皿和移液器、分装的试剂用后即应丢弃，不要重新贮藏。(2)如有可能应在装有紫外灯的无菌操作台中预备和举行pcr。无论何时只要无菌操作台不用，就应打开紫外灯。并将微型离心机、一次性手套、各种用具及用于pcr的各种移液器所有都放在无菌操作台内。因为微量可调移液器的套筒部分往往是污染源，因此应当用带一次性吸头和活塞的正置换移液器吸取试剂。全

3、部缓冲液、移液器吸头及离心管在用法前都应高压灭菌。(3)在打开装有pcr试剂的小离心管前，先用无菌操作台中的微量离心机短促离心10s，使液体沉到离心管底部以削减手套和移液器污染的可能性。(4)在加模板dna之前最好先将全部其他反应成分加入到微型离心管中，包括加入防止蒸发的矿物油，最后再加入模板dna，盖好离心管，用戴手套手指轻轻弹打离心管中壁，混合溶液短促离心10s，使有机相与水相分开，然后举行pcr。(5)只要可能应设立一个正对比(即含少量合适目的序列的pcr)，应预先在试验室其他地方预备一份适当稀释的目的序列溶液，以避开将目的dna的浓溶液带到特地举行pcr的工作区内。同时应设立除模板之外

4、含全部pcr成分的负对比，以便检查反应中是否存在污染的dna。在工作中常常碰到上一次试验扩增的产物污染下一次扩增反应的状况，利用perkin el-mer cetus公司的carryover prevention试剂盒可防止这种污染。该试剂盒的工作原理如下：用dutp代替dttp举行反应，由于tagdna聚合酶同样能利用dutp举行合成反应，使所得产物中含有dutp，这种含有dutp的产物与含dttp的产物一样可举行杂交、克隆或其他反应，使来自上一轮反应的污染dna被降解除去。因为ung作用于单链或双链dna中的du，对其他反应底物(包括rna链中的u和底物中的dutp)都没有影响，故扩增反应

5、仍可举行。(七)pcr技术在转基因食品检测中的应用pcr技术具有特异、敏捷、自动化、快捷等优点，使其在食品检验中发挥着重要作用，并且有着巨大的进展潜力：目前pcr技术在食品检验中可用于食源性致病菌检测(如沙门菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等的检验)、益生菌检测(如对乳酸菌菌种的鉴定和鉴别等)、动物源性成分检测(如对各类肉制品检测的靶基因主要为真核生物18s rrna基因和线粒体细胞色素b基因等)、食品真伪鉴定(如通过鉴定大米内参基因而推断蜂蜜中是否掺入大米糖浆等)、食品过敏原成分检测(选取物种特异性基因作为靶基因，如编码大豆植物凝集素lectin基因、编码玉米植物醇溶蛋白zein基因等)、转基

6、因食品检测等方面，以下就pcr技术在转基因食品检测中的应用举行举例介绍。转基因食品又称遗传修饰食品(genetically modified food)，简称gmf或gm食品。转基因产品的平安性向来是世界各国及联合国等国际组织关怀的焦点，据统计，全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律规矩，转基因产品的讨论、生产、销售都要求在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点举行：对转基因产品的检测管理越来越严格。pcr技术是目前转基因食品检测的主要办法。利用与外源基因序列互补的特定引物对转基因食品中的外源dna序列举行pcr扩增后分析，不仅可以对转基因食品举行定性鉴别，改良后也可以对

7、转基因成分举行定量分析。1. pc r技术对转基因食品的定性检测目前基于gmo特异外源dna片段的定性pcr筛选办法已广泛应用于转基因生物及食品的检测，一些国家将此作为本国有关食品规矩的标准检验办法。pcr检测转基因食品的基本步骤：待检材料dna提取：通常利用ctab法从食品材料中提取核酸； pcr反应：设计合适引物，pcr扩增待检样品中的靶标dna;观测pcr产物：通过凝胶电泳分析将pcr产物呈现；确定结果：有时为了避开假阳性，还需要对pcr产物举行限制性酶切分析举行质量控制。如采纳一对引物5'-ccg aca gtg gtccca aag atg gac-3'和5'

8、-ata tag agg aag ggt ctt gcg aag g-3'扩增camv35s启动子获得162 bp产物，用ecorv酶切可得到98和64bp两个片段；采纳一对引物5'-gaa tcc tgt tgc cgg tct tgc gat g-3'和5'-tcg cgt att aaa tgt ata att gcg gga ctc-3'扩增nos终止子获得146bp产物，利用afliii酶切可得到72 bp和74bp两个片段。如酶切产物与预计片段大小全都可确定食品中含有转基因成分。pcr检测转基因食品的优点：敏捷度高，检测快速；无论外源基因在受

9、体生物中是否表达，只要其dna存在，就能被检测，同时适用于加工过的转基因食品；基于启动子和终止子调控序列的检测办法无须了解产品的转基因背景即可对其举行是否含有转基因成分举行筛选鉴定。pcr检测转基因食品的局限性和缺点：操作程序烦琐，需要对样品dna举行提取，对某些材料可能浮现假阳性。有些植物和土壤微生物含有camv35s启动子或nos终止子简单造成假阳性结果：十字花科植物如油菜易自然感染camv病毒，如对进口转基因油菜针对35s设计引物举行检测，则可能将感染病毒的非转基因油菜判定为转基因产品从而引起贸易纠纷。此外，因为pcr检测极为敏捷，囫囵操作过程极为严格，检测时简单遭到污染而浮现假阳性结果

10、，如离心管、移液器等器皿污染，或转基因样品对非转基因样品的交错污染等。易浮现假阴性。随着转基因食品商品化进程加快，越来越多的目的基因将被导入更多的食品作物中，用法的启动子和终止子的种类将不再局限于目前几种，因此常规的pcr检测可能越来越多地浮现假阴性转基因食品中作为待检模板的核酸可能在食品加工处理过程中遭到降解或破坏，从而不能被检测而浮现假阴性结果，此外转基因样品dna提取质量不高不时因含有pcr反应抑制物而浮现假阴性。pcr检测大部分状况下只能检测1种目标分子，在少数状况下能同时检测2到3种目标分子，不能高通量大规模对进出口产品举行检测。2. pc r技术对转基因食品的定量检测目前基于gmo

11、特异dna片段的定性pcr筛选办法己广泛应用于gmo食品检测，但是随着各国有关gmo标签法的建立和不断完美，对食品中的gmo含量的下限已有所规定。为此，讨论者在定性筛选pcr办法的基础上进展了不同的定量gmo的pcr检测办法。目前，国外较为成熟的办法主要有半定量pcr法、定量竞争pcr和实时荧光定量pcr等。(1)半定量pcr法pcr反应具有高度特异性和敏感性，只需对少量的dna举行测定便可检测gmo成分，但对试验技术的要求很高，其结果易受许多因素的干扰而产生误差，如操作人员移液时的误差、器皿用品的交错污染等，还有pcr反应体系存在的抑制因素也可带来干扰，普通pcr只用作转基因是食品的定性筛选

12、检测。针对所存在问题，讨论人员在试验设计中引入内部参照反应，以消退检测时的干扰，并与已知含量的系列gmo标准样的pcr结果举行比较，从而可以半定量地检测待测样品的gmo含量。(2)定量竞争pcr法pcr反应实质是对特定模板dna的指数扩增放大，而在相同的条件下，获得dna的量与最初模板dna的浓度呈正相关，竟争定量pcr就是依据这种扩增dna与模板dna之间的浓度相关性设计的。基本原理是先构建含有修饰过的内部标准dna片段(竟争dna)，竞争dna由质粒组成，带有一个改造pcr扩增子，改造部分可以是dna插入序列、缺失序列或者点突变，竞争dna与待测目标dna在同一反应管中举行pcr共扩增，因竞争dna片段和待测dna的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，同过比较两种条带的量可举行定量分析。(3)实时荧光定量pcr此办法在pcr反应体系中加入分离在其5'和3'互补的一个内部核酸探针，该探针5'端标志有荧光剂，3'端淬灭剂。pcr反应前，新的核酸链没有合成，探针的5'端和3'端互补形成双链，荧光剂和淬灭剂的位置相近，荧光剂发出的荧光被淬灭剂淬灭，检测不到荧光信号。pcr反应开头后，退火时，探针与模板杂交，在新链延长过程中，通过taqdna聚合酶5核酸外切酶活