酶的结构与功能学习教案

1、会计学1酶的结构与功能酶的结构与功能第一页，编辑于星期二：十点 十四分。酶的发现及研究历史酶的发现及研究历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前公元前1212世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴春秋战国时期已知用麴( (曲曲) )治疗消化不良的疾病治疗消化不良的疾病。 酶者，酒母也酶者，酒母也第一节第一节 酶引论酶引论第1页/共114页第二页，编辑于星期二：十点 十四分。第2页/共114页第三页，编辑于星期二：十点 十四分。第3页/共114页

2、第四页，编辑于星期二：十点 十四分。（一）与一般催化剂相同的特点（一）与一般催化剂相同的特点第4页/共114页第五页，编辑于星期二：十点 十四分。过渡态过渡态第5页/共114页第六页，编辑于星期二：十点 十四分。 活化能活化能(activation energy) 指在一定温度下，指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态底物全部进入活化态所需要的自由能所需要的自由能 单位：单位：KJ/mol酶催化反应的实质：降低反应的活化能第6页/共114页第七页，编辑于星期二：十点 十四分。1. 1. 高效性高效性且且无副反应无副反应反应速度是无酶催化反应速度是无酶催化/ /普通人造催化剂催普通人造催化剂

3、催化反应速度的化反应速度的10105 510101717倍。倍。（二）（二） 生物催化剂的特点生物催化剂的特点第7页/共114页第八页，编辑于星期二：十点 十四分。例：双氧水裂解例：双氧水裂解第8页/共114页第九页，编辑于星期二：十点 十四分。2.2.专一性专一性Specificity: 酶对催化的反应和反应物有酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。严格的选择性。底物（底物（substrate): 酶作用的物质。酶作用的物质。第9页/共114页第十页，编辑于星期二：十点 十四分。3. 3. 可调节性可调节性 为为P所抑制所抑制 A B C D P（终产物）（终产物） 图图 通过终产物可逆的

4、结合对途径中的第通过终产物可逆的结合对途径中的第1个酶反馈抑制个酶反馈抑制 第10页/共114页第十一页，编辑于星期二：十点 十四分。常温、常压、中性常温、常压、中性5.5.催化活性与结构有关催化活性与结构有关 生物固氮：生物固氮：工业氨合成：工业氨合成：N2+3H2 500 ,300大气大气压压Fe2NH3第11页/共114页第十二页，编辑于星期二：十点 十四分。反应反应化学本质是蛋白质化学本质是蛋白质（一）酶的化学本质（一）酶的化学本质第12页/共114页第十三页，编辑于星期二：十点 十四分。1982年年T.Cech发现了第发现了第1个有催化活性个有催化活性的天然的天然RNAribozym

5、e（核酶），（核酶），以后又陆续发现了真正的以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。催化剂。19951995年，年，Jack W. Szostak Jack W. Szostak 研究室首先报道研究室首先报道了具有了具有DNADNA连接酶活性的连接酶活性的DNADNA片段，称之为片段，称之为脱氧核酶脱氧核酶( (deoxyribozyme) )，为生物催化，为生物催化剂的发展作出了新的贡献。剂的发展作出了新的贡献。第13页/共114页第十四页，编辑于星期二：十点 十四分。（prosthetic group） （coenzyme） 全酶全酶（二）酶的化学组成（二）酶的化学组成根据酶的根据酶的组成成份

6、：组成成份： 第14页/共114页第十五页，编辑于星期二：十点 十四分。羧肽酶第15页/共114页第十六页，编辑于星期二：十点 十四分。NADPH脱氢酶的辅酶过氧化氢酶第16页/共114页第十七页，编辑于星期二：十点 十四分。第17页/共114页第十八页，编辑于星期二：十点 十四分。酶蛋白：决定反应的专一性辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用第18页/共114页第十九页，编辑于星期二：十点 十四分。第19页/共114页第二十页，编辑于星期二：十点 十四分。（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体体根据酶蛋白分子的特点：根据酶蛋白分子的特点：第20页/共114页第

7、二十一页，编辑于星期二：十点 十四分。第21页/共114页第二十二页，编辑于星期二：十点 十四分。（一）习惯命名法（一）习惯命名法根据其催化底物来命名；根据其催化底物来命名；根据所催化反应的性质来命名；根据所催化反应的性质来命名；结合上述两个原则来命名，结合上述两个原则来命名，有时在这些命名基础上加上酶的来源有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。或其它特点。（略讲）（略讲）第22页/共114页第二十三页，编辑于星期二：十点 十四分。 优点优点 命名简单命名简单应用历史较长，使用方便应用历史较长，使用方便 缺点缺点一名数酶、一酶数名一名数酶、一酶数名 为了适应酶学发展的新情况，国际酶学为了

8、适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于会议于19611961年提出一个新的系统命名年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采法及分类原则，已被国际生化协会采用。用。第23页/共114页第二十四页，编辑于星期二：十点 十四分。（二）国际系统命名法：（二）国际系统命名法： 系统名称包括底物名称、反应性质系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字，最后加一个酶字。第24页/共114页第二十五页，编辑于星期二：十点 十四分。乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶当底物为水时，可省略当底物为水时，可省略第25页/共114页第二十六

9、页，编辑于星期二：十点 十四分。I 系统名系统名：包括所有底物的名称和反应类型。包括所有底物的名称和反应类型。乳酸乳酸 + NAD+丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+乳酸：乳酸：NAD+氧化还原氧化还原酶酶I 惯用名惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。只取较重要的底物名称和反应类型。乳酸：乳酸：NAD+氧化还原氧化还原酶酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。第26页/共114页第二十七页，编辑于星期二：十点 十四分。（三）国际系统分类编号（三）国际系统分类编号G 1961 1961年国际酶学委员会（年国际

10、酶学委员会（Enzyme Enzyme Committee, ECCommittee, EC）根据酶所催化的反应类）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成型和机理，把酶分成6 6大类：大类：第27页/共114页第二十八页，编辑于星期二：十点 十四分。第28页/共114页第二十九页，编辑于星期二：十点 十四分。第29页/共114页第三十页，编辑于星期二：十点 十四分。 氧化氧化- -还原酶催化氧化还原酶催化氧化- -还原反应，催化氢的转移还原反应，催化氢的转移或电子传递。或电子传递。 主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxi

11、dase)(Oxidase)。 如，乳酸如，乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1 1、氧化还原酶、氧化还原酶 OxidoreductaseOxidoreductaseCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADHAH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）（四）六大类酶的特征（四）六大类酶的特征第30页/共114页第三十一页，编辑于星期二：十点 十四分。（1）脱氢酶类）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应：催化直接从底物上脱氢的反应AH2 +BA +BH2（需辅酶（需辅酶或辅酶或辅酶）（2）氧化酶类）氧化酶类催

12、化底物脱氢，氧化生成催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需（需FAD或或FMN）催化底物脱氢，氧化生成催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）过氧化物酶）过氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2第31页/共114页第三十二页，编辑于星期二：十点 十四分。（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺（顺，顺-已二烯二酸）已二烯二酸）RH + O2 + 还原型辅助因子还原型辅助因子ROH + H2O + 氧化型辅助因子氧化型辅助因子（又称（又称羟化酶羟化酶）第

13、32页/共114页第三十三页，编辑于星期二：十点 十四分。 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。的基团或原子转移到另一个底物的分子上。根据根据X X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如，例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2 2、转移酶、转移酶 TransferaseTransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CH

14、COOHNH2CH3CCOOHOAX + BA +BX第33页/共114页第三十四页，编辑于星期二：十点 十四分。 水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：3 3、水解酶、水解酶 hydrolasehydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHAB + H2OAOH + BH第34页/共114页第三十五页，编辑于星期二：十点 十四分。 裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或裂合酶

15、催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如，例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。4 4、裂合酶、裂合酶 LyaseLyaseHOOCCH=CHCOOH H2OHOOCCH2CHCOOHOH第35页/共114页第三十六页，编辑于星期二：十点 十四分。 异构酶催化各种同分异构体的相互转化异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程，即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如，例如，6-6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应磷酸葡萄糖异构酶

16、催化的反应5 5、异构酶、异构酶 IsomeraseIsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOHABPP第36页/共114页第三十七页，编辑于星期二：十点 十四分。 合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类键的形成反应。这类反应必须与反应必须与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸丙酮酸 + + COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸6 6、合成酶、合成酶 Ligase or Sy

17、nthetaseA + B + ATPAB + ADP +Pi第37页/共114页第三十八页，编辑于星期二：十点 十四分。乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号第38页/共114页第三十九页，编辑于星期二：十点 十四分。结构专一性结构专一性立体专一性立体专一性绝对专一性绝对专一性相对专一性相对专一性基团专一性基团专一性键专一性键专一性旋光异构专一性旋光异构专一性（D-D-、L-L-）几何异构专一性几何异构专一性( (顺、反异构顺、反异构) )四、酶的专一性（一）酶的专一性（一）酶的专一性第

18、39页/共114页第四十页，编辑于星期二：十点 十四分。基团专一性基团专一性胰蛋白酶胰蛋白酶第40页/共114页第四十一页，编辑于星期二：十点 十四分。（二）与酶专一性有关的学说（二）与酶专一性有关的学说第41页/共114页第四十二页，编辑于星期二：十点 十四分。锁钥学说锁钥学说 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样的结合如同一把钥匙对一把锁一样第42页/共114页第四十三页，编辑于星期二：十点 十四分。“三点结合三点结合”的催化理论的催化理论 酶与底物的结

19、合酶与底物的结合处至少有三个点处至少有三个点，而且只有一种，而且只有一种情况是完全结合情况是完全结合的形式。只有这的形式。只有这种情况下，不对种情况下，不对称催化作用才能称催化作用才能实现。实现。第43页/共114页第四十四页，编辑于星期二：十点 十四分。第44页/共114页第四十五页，编辑于星期二：十点 十四分。诱导契合学说诱导契合学说酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状底物的诱导才形成了互补形状. . （Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象

20、变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。正确空间位置，有利于催化。第45页/共114页第四十六页，编辑于星期二：十点 十四分。第46页/共114页第四十七页，编辑于星期二：十点 十四分。（三）研究酶的专一性的意义（三）研究酶的专一性的意义 理论上理论上，专一性弱键和结构互补成为理，专一性弱键和结构互补成为理解生物大分子之间相互作用的基石。解生物大分子之间相互作用的基石。 实践上实践上也有重要意义。例如，某药物具有某也有重要意义。例如，某药物具有某一种构型才有生理效用，而有机合成的是消旋一种构型才有生理效用，而

21、有机合成的是消旋混混合物合物, , 若用酶可以进行不对称合成或不对称拆分若用酶可以进行不对称合成或不对称拆分, ,即得到单一构型的药物。即得到单一构型的药物。第47页/共114页第四十八页，编辑于星期二：十点 十四分。 五、酶的活力测定和分离纯化（一）（一） 酶活力与酶促反应速度酶活力与酶促反应速度1 1、酶活力（、酶活力（enzyme activityenzyme activity） 酶活力就是酶活力就是酶催化某一化学反应的能力。酶催化某一化学反应的能力。可以用它催化某一化学反应的可以用它催化某一化学反应的速度速度来表示。来表示。 酶活力的大小代表酶的量酶活力的大小代表酶的量 第48页/共1

22、14页第四十九页，编辑于星期二：十点 十四分。ug一定时间一定时间一定量底一定量底物物一定条件下一定条件下第49页/共114页第五十页，编辑于星期二：十点 十四分。标准化标准化（1）国际单位（）国际单位（IU）第50页/共114页第五十一页，编辑于星期二：十点 十四分。（2）Kat第51页/共114页第五十二页，编辑于星期二：十点 十四分。每每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。酶蛋白所含的酶活力单位数。 U/mg酶蛋白酶蛋白、 U/ml酶蛋白酶蛋白酶产品质量评价中常使用，一定程度上酶产品质量评价中常使用，一定程度上代表酶的纯度。代表酶的纯度。（3 3）比活力）比活力 (specific activ

23、ity)比活力越大，酶的纯度越高比活力越大，酶的纯度越高第52页/共114页第五十三页，编辑于星期二：十点 十四分。一定条件下：一定条件下：w每秒钟、每个酶分子转换的底物分子每秒钟、每个酶分子转换的底物分子数数w或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数数w一秒内一秒内1摩尔的酶可催化几摩尔的底物摩尔的酶可催化几摩尔的底物 （4 4）转换数）转换数（turnover number，TN） 反应酶的反应酶的催化活性中心催化活性中心的活性的活性 第53页/共114页第五十四页，编辑于星期二：十点 十四分。用哪一个速度来表示酶促反应的用哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？速

24、度特征呢？反应初速度反应初速度 Vo逐渐逐渐降低降低酶反应进程曲线酶反应进程曲线在酶促反应开始无任何干扰因素在酶促反应开始无任何干扰因素出现时出现时, , 短时间内酶的反应速度。短时间内酶的反应速度。一般指一般指反应底物消耗反应底物消耗5%5%以内以内时的反应速时的反应速率率 。3. 酶促反应速度酶促反应速度单位时间内底物单位时间内底物(S)(S)的减少量或产物的减少量或产物(P)(P)的增加量的增加量Why?第54页/共114页第五十五页，编辑于星期二：十点 十四分。反应速度逐渐降低的原因：反应速度逐渐降低的原因：底物浓度的降低；底物浓度的降低； 产物的生成逐渐增大了逆反应；产物的生成逐渐增

25、大了逆反应； 酶在反应酶在反应中失活；中失活； 产物对酶的抑制产物对酶的抑制 10 20 30 40 50 60 （min）产物生成量产物生成量酶反应进程曲线酶反应进程曲线反应初速度表示酶活力反应初速度表示酶活力第55页/共114页第五十六页，编辑于星期二：十点 十四分。（二）酶活力的测定（二）酶活力的测定酶反应速度的测量酶反应速度的测量测量单位时间内测量单位时间内底物底物的消耗量。的消耗量。测量单位时间内测量单位时间内产物产物的生成量。的生成量。浓度浓度时间时间产物产物P反应物反应物S第56页/共114页第五十七页，编辑于星期二：十点 十四分。（1 1）应测）应测反应初速度反应初速度（ini

26、tial velocityinitial velocity） 底物浓度变化在底物浓度变化在起始浓度起始浓度5%5%以内以内。 （2 2）酶的反应速度一般用单位时间内）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增产物的增 加加量量来表示。来表示。 （3 3）测酶活力时应使反应温度、）测酶活力时应使反应温度、pHpH、离子强度和底物、离子强度和底物浓度等浓度等因素保持恒定因素保持恒定。 （4 4）测定酶反应速度时，应使）测定酶反应速度时，应使SESE。 1 1、测定酶活力的注意事项、测定酶活力的注意事项 第57页/共114页第五十八页，编辑于星期二：十点 十四分。2 2、 酶活力的测定方法酶活力的测定方法

27、（1 1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometryspectrophotometry） 该法要求酶的该法要求酶的底物和产物底物和产物在紫外或可见光部分在紫外或可见光部分光光吸收不同吸收不同。 优点：简便、迅速、准确；一个样品可优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测定多次测定；可检测到；可检测到1010-9-9mol/Lmol/L水平的变化。水平的变化。例例: : 人血清乳酸脱氢酶活力的测定人血清乳酸脱氢酶活力的测定 L-L-乳酸乳酸 + NAD+ NAD+ + 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ NADH + H+ + 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶第58页/共114页第五十九页

28、，编辑于星期二：十点 十四分。第59页/共114页第六十页，编辑于星期二：十点 十四分。（2 2）荧光法（）荧光法（fluorometryfluorometry） 该法要求酶反应的该法要求酶反应的底物或产物有荧光底物或产物有荧光变化。变化。 主要的优点：灵敏度很高，可测主要的优点：灵敏度很高，可测1010-12-12mol/Lmol/L的样品的样品。 酶蛋白分子中的酶蛋白分子中的TyrTyr、TrpTrp、PhePhe残基以及一些辅残基以及一些辅酶、辅基，如酶、辅基，如NADH NADPHNADH NADPH、FMNFMN、FADFAD等都能等都能发出荧光。发出荧光。 例：乙醇例：乙醇 + N

29、AD+ NAD+ + 乙醛乙醛 + NADH + H+ NADH + H+ + 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶第60页/共114页第六十一页，编辑于星期二：十点 十四分。（3 3）酶偶联分析法）酶偶联分析法(enzyme coupling assay)(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。酶系统在一起反应。 P P1 1无光吸收或荧光变化无光吸收或荧光变化，偶联后，偶联后, , P P2 2有光吸有光吸收或荧光变化收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性例：测己糖激酶的活性 葡萄糖葡萄糖 + ATP + A

30、TP 葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸 + ADP + ADP 己糖激酶己糖激酶葡糖葡糖-6-6-磷酸磷酸 + NADP + NADP 葡糖酸葡糖酸-6-6-磷酸磷酸 + NADPH + H+ NADPH + H+ + G-6-PG-6-P脱氢酶脱氢酶第61页/共114页第六十二页，编辑于星期二：十点 十四分。（4 4）电化学法（）电化学法（electrochemical methodelectrochemical method） 有有pHpH测定法、测定法、离子选择性电极法离子选择性电极法等。等。离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子浓度离子浓度的变化

31、的变化或气体的变化或气体的变化（如（如O O2 2、COCO2 2、NHNH3 3等）。等）。 例例: : 葡萄糖氧化酶活性的测定葡萄糖氧化酶活性的测定 葡萄糖葡萄糖+O+O2 2+H+H2 2O O 葡糖酸葡糖酸+H+H2 2O O2 2 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（5 5）同位素法）同位素法放射性放射性同位素标记底物同位素标记底物，经酶作用得到相应产物，经酶作用得到相应产物，经适当分离，经适当分离，测定产物脉冲数测定产物脉冲数即可。即可。 第62页/共114页第六十三页，编辑于星期二：十点 十四分。脂肪酶脂肪酶第63页/共114页第六十四页，编辑于星期二：十点 十四分。分离纯化方法同蛋白质纯

32、化类似：分离纯化方法同蛋白质纯化类似：1.选材：酶含量丰富的新鲜生物材料选材：酶含量丰富的新鲜生物材料2.细胞破碎：因材料而异细胞破碎：因材料而异3.抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提4.分离及纯化：粗分级，细分级分离分离及纯化：粗分级，细分级分离5. 结晶结晶6.保存：低温下酶粉可长期保存保存：低温下酶粉可长期保存注意低浓度酶溶液易变性注意低浓度酶溶液易变性（三）酶的分离和纯化（三）酶的分离和纯化第64页/共114页第六十五页，编辑于星期二：十点 十四分。酶的分离纯化酶的分离纯化溶解溶解度的度的差异差异盐析法盐析法PEGPEG沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉

33、淀法等电点沉淀法等电点沉淀法热稳定性的差异热稳定性的差异热处理沉淀法热处理沉淀法第65页/共114页第六十六页，编辑于星期二：十点 十四分。电荷性质的差异电荷性质的差异离子交换层析法离子交换层析法电泳法电泳法分子大小和分子大小和形状的差异形状的差异凝胶过滤法凝胶过滤法超滤法超滤法透析法透析法离心法离心法亲和力的差异亲和力的差异亲和层析法亲和层析法疏水作用的差异疏水作用的差异疏水层析法疏水层析法分配系数的差异分配系数的差异双水相系统萃取法双水相系统萃取法第66页/共114页第六十七页，编辑于星期二：十点 十四分。由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : :1 1全

34、部操作在低温全部操作在低温0 044。 2 2在分离提纯过程中，在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌不能剧烈搅拌。 3 3在提纯溶剂中在提纯溶剂中加一些保护剂加一些保护剂，如少量，如少量EDTAEDTA、 少量少量-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。 4 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和回收率（得率，从而求得比活力，还要计算总活力和回收率（得率）。）。 第67页/共114页第六十八页，编辑于星期二：十点 十四分。酶的纯度：酶的纯度：= = 活力单位数活力单位数/ mL/ mL酶液酶液总体积（总体

35、积（ mLmL） = = 活力单位数活力单位数/ / 毫克蛋白毫克蛋白 = = 每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力= = 100100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、分子筛层析等。法、分子筛层析等。第68页/共114页第六十九页，编辑于星期二：十点 十四分。衡量分离提纯效果的两个指标衡量分离提纯效果的两个指标总活力的回收总活力的回收得率得率（回收率）（回收率） 是表示提纯过程中酶的损失情况是表示提纯过程中酶的损失情况比活力提高的倍数比活力提高的倍数 是表示提纯方法的有效程度

36、是表示提纯方法的有效程度第69页/共114页第七十页，编辑于星期二：十点 十四分。酶的分离纯化过程中一定酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性要随时追踪酶的活性第70页/共114页第七十一页，编辑于星期二：十点 十四分。19821982年美国科学家年美国科学家AltmanAltman和和CechCech研究研究Tetrahymena thermophieaTetrahymena thermophiea（ 嗜热四膜虫嗜热四膜虫） rRNArRNA前体加工成熟时，发现具有催化前体加工成熟时，发现具有催化活性（自我剪切功能）的天然活性（自我剪切功能）的天然RNARNA。19831983年美国年美国

37、S.AltmanS.Altman等研究等研究 E.coli RNasePE.coli RNaseP（由（由23%23%蛋白质和蛋白质和77%77%的的RNARNA组成），发现组成），发现RNasePRNaseP中中的的RNARNA可催化可催化E.coli tRNAE.coli tRNA的前体加的前体加工。工。 （一）核酶的发现（一）核酶的发现第71页/共114页第七十二页，编辑于星期二：十点 十四分。 1986 1986年，年，T. CechT. Cech又发现又发现 L19 RNA L19 RNA 在一定在一定的条件下能以高度专一性方式催化寡核苷酸底物的条件下能以高度专一性方式催化寡核苷酸底

38、物的切割与连接。的切割与连接。 基于基于CechCech和和AltmanAltman的创造性工作，将这类具的创造性工作，将这类具有酶一样的催化功能，本质上不是蛋白质而是有酶一样的催化功能，本质上不是蛋白质而是RNARNA的生物大分子定义为的生物大分子定义为RibozymesRibozymes。 该发现曾被认为是生化领域内最令人鼓舞的该发现曾被认为是生化领域内最令人鼓舞的发现之一，为此发现之一，为此CechCech和和AltmanAltman共同荣获共同荣获19891989年年度度诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。第72页/共114页第七十三页，编辑于星期二：十点 十四分。随后的研究表明：随后的研究表

39、明： L19RNAL19RNA具备酶促催化的几个特征：具备酶促催化的几个特征： 高度的底物专一性高度的底物专一性 遵循遵循Michaelis-MentenMichaelis-Menten动力学动力学 对竞争性抑制剂的敏感性对竞争性抑制剂的敏感性第73页/共114页第七十四页，编辑于星期二：十点 十四分。 -CpUpCpU +GpN -CpUpCpU +GpN 第74页/共114页第七十五页，编辑于星期二：十点 十四分。均包括均包括RNA+蛋白组分，蛋白组分，起催化作用的都是起催化作用的都是RNA。第75页/共114页第七十六页，编辑于星期二：十点 十四分。I I型内含子：需要鸟苷型内含子：需要

40、鸟苷和和MgMg2+2+参与参与II型内含子：不需要鸟型内含子：不需要鸟苷的参与苷的参与剪切与连接剪切与连接催化催化分子内分子内反应反应催化催化分子间分子间反应：反应：按按作用底物作用底物 如如RNase PRNase P、L19RNA L19RNA 第76页/共114页第七十七页，编辑于星期二：十点 十四分。自我剪切核酶包括：发夹结构核酶、锤头结构核酶自我剪切核酶包括：发夹结构核酶、锤头结构核酶、丁型肝炎病毒（、丁型肝炎病毒（HDVHDV）核酶等。）核酶等。（1）发夹结构核酶发夹结构核酶由由4 4个螺旋区和数个环状区组成个螺旋区和数个环状区组成 切割活性所需最小长度为切割活性所需最小长度为5

41、050个核苷酸个核苷酸螺旋螺旋、决定核酶切割部位的特异性，决定核酶切割部位的特异性，螺旋螺旋配对碱基及其配对碱基及其33端的未配对碱基端的未配对碱基均为切割活性所必需均为切割活性所必需 结构特点结构特点第77页/共114页第七十八页，编辑于星期二：十点 十四分。结构特点结构特点 三个螺旋三个螺旋 1313个保守碱基个保守碱基 剪切点：剪切点：GUN GUN （2 2）锤头结构核酶）锤头结构核酶 （3 3）HDVHDV核酶和核酶和VS RNA VS RNA 第78页/共114页第七十九页，编辑于星期二：十点 十四分。（三）核酶的研究意义与应用前景（三）核酶的研究意义与应用前景1 1、研究意义、研

42、究意义 突破了生物体内所有的突破了生物体内所有的“生物催化剂都是蛋白质生物催化剂都是蛋白质”的传统的传统观念；观念；对生命起源这一问题有了新的认识对生命起源这一问题有了新的认识 ；从生物进化角度来看，生物催化剂从核酶到蛋白质的从生物进化角度来看，生物催化剂从核酶到蛋白质的转变，伴随着生物代谢高效率和生命现象的更趋复杂转变，伴随着生物代谢高效率和生命现象的更趋复杂。 第79页/共114页第八十页，编辑于星期二：十点 十四分。2 2、应用前景、应用前景 可以设计出自然界不存在的各种核酶。可以设计出自然界不存在的各种核酶。 核酶基因研究前景诱人，在基因治疗领域中倍核酶基因研究前景诱人，在基因治疗领域

43、中倍受青睐，其研究进展也相当迅速。受青睐，其研究进展也相当迅速。 第80页/共114页第八十一页，编辑于星期二：十点 十四分。 酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶进行修酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。包括：需产品的一项技术。包括：( (酶学酶学+ +化学工程技术化学工程技术) ) 利用化学工程手段，改善酶的性能，提高催化效率利用化学工程手段，改善酶的性能，提高催化效率, , 降低降低成本。包括：天然酶、化学修饰酶、固定化酶、人工酶成本。包括：天然酶、化学修饰酶、固定化酶、人

44、工酶：( (酶学酶学+ +现代分子生物学技术现代分子生物学技术) ) 以以DNADNA重组技术为核心。包括：克隆酶、突变酶等。重组技术为核心。包括：克隆酶、突变酶等。第81页/共114页第八十二页，编辑于星期二：十点 十四分。w化学酶工程化学酶工程 酶酶分子表面分子表面的修饰，酶的修饰，酶分子内部分子内部的修饰，化的修饰，化学合成人工酶学合成人工酶 。1、微生物发酵得到粗酶、微生物发酵得到粗酶2、对天然酶进行、对天然酶进行化学修饰化学修饰、固定化处理固定化处理， 利用利用化学合成化学合成等手段来改善酶性能。等手段来改善酶性能。天然酶天然酶 第82页/共114页第八十三页，编辑于星期二：十点 十

45、四分。 利用化学的手段对酶分子上的利用化学的手段对酶分子上的氨基酸侧链基团氨基酸侧链基团进进行修饰，改善酶的性能，行修饰，改善酶的性能，以适用于以适用于工业工业的应用及的应用及研究工作的要求。研究工作的要求。1、酶化学修饰的基本方法、酶化学修饰的基本方法 （1）酶分子侧链基团的化学修饰）酶分子侧链基团的化学修饰 修饰酶的功能基团：修饰酶的功能基团： -NH3、 -SH、 -COOH 、咪唑基、酚、咪唑基、酚羟基、吲哚基、胍基、甲硫基等。羟基、吲哚基、胍基、甲硫基等。修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等类型。芳香环取代反

46、应等类型。（一）化学修饰酶（一）化学修饰酶第83页/共114页第八十四页，编辑于星期二：十点 十四分。 其中水溶性的碳二亚胺类其中水溶性的碳二亚胺类 特定修饰已成为最普遍的标特定修饰已成为最普遍的标准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下，准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下，SerSer、CysCys和和TyrTyr也可反应。也可反应。羧基的修饰羧基的修饰OENZCOCN+HRN+HRENZOCON+NCRRHOENZCXOCN+HRN+HR+ H+pH5HX（卤素）（卤素）H+R,R为烷基，为烷基，HX 为卤素、一级或二级胺；为卤素、一级或二级胺；ENZ为酶为酶第84页/共

47、114页第八十五页，编辑于星期二：十点 十四分。 LysLys的的-NH-NH2 2可采用烷基化反应来修饰。修饰剂包括有可采用烷基化反应来修饰。修饰剂包括有乙酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸乙酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸。其中，三硝基。其中，三硝基苯磺酸（苯磺酸（TNBSTNBS）是种非常有效的氨基修饰剂。反应后在）是种非常有效的氨基修饰剂。反应后在420nm420nm和和367nm367nm能够产生特定的光吸收。能够产生特定的光吸收。氨基的修饰氨基的修饰O2NO2NNO2HO3S ENZNH2+pH7O2NO2NNO2NH ENZ第85页/共114页第八十六页，编辑于星期二：十点 十

48、四分。 此外，磷酸吡哆醛（此外，磷酸吡哆醛（PLPPLP）、氰酸盐、及蛋白质测）、氰酸盐、及蛋白质测序中用的序中用的DNSDNS（丹磺酰氯）、苯异硫氰酸酯（丹磺酰氯）、苯异硫氰酸酯（PITCPITC）都）都可作为修饰剂。可作为修饰剂。ENZNH2+SO2ClN(CH3)2ENZNHSO2N(CH3)2+Cl-H+丹磺酰丹磺酰氯氯第86页/共114页第八十七页，编辑于星期二：十点 十四分。 具有两个邻位羟基的化合物。如丁二酮、具有两个邻位羟基的化合物。如丁二酮、1 1，2-2-环己环己二酮、苯异二醛，都是重要的修饰剂。二酮、苯异二醛，都是重要的修饰剂。胍基的修饰：胍基的修饰：ENZNCNH2NH

49、2OO+NCENZNH NHOH OH硼酸盐硼酸盐NCENZNH NH O OBOH OH第87页/共114页第八十八页，编辑于星期二：十点 十四分。 烷基化试剂是一种酶修饰剂，如碘乙酸。修饰产物相当稳定，易于分析。烷基化试剂是一种酶修饰剂，如碘乙酸。修饰产物相当稳定，易于分析。此外，马来酸酐、马来酰亚胺等修饰剂与巯基形成对酸稳定的衍生物。此外，马来酸酐、马来酰亚胺等修饰剂与巯基形成对酸稳定的衍生物。 2-2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（DTNBDTNB），与），与-SH-SH反应形成反应形成S-SS-S，释放出一个，释放出一个2-2-硝基硝基- -5-5-硫苯甲酸阴离子。在硫苯甲酸阴离子。在41

50、2nm412nm处有最大吸收。因而能通过光吸收的变处有最大吸收。因而能通过光吸收的变化跟踪反应程度。化跟踪反应程度。巯基的修饰巯基的修饰5,55,5- -二硫代二硫代- -（2-2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（DTNBDTNB）ENZNO2COO-SSENZSH+-OOCO2NSSNO2COO-NO2COO-SpHpH6.86.8有机汞试剂（如对氯汞苯甲酸）对巯基专一性强，反应物在有机汞试剂（如对氯汞苯甲酸）对巯基专一性强，反应物在250nm处有吸收处有吸收第88页/共114页第八十九页，编辑于星期二：十点 十四分。 常用的修饰剂有，焦碳酸二乙酯（常用的修饰剂有，焦碳酸二乙酯（DPCDPC）、碘代

51、乙酸，）、碘代乙酸，能修饰咪唑基的两个能修饰咪唑基的两个N N原子。原子。NNHENZENZNNCH2COO+ CH3CH2OH + CO2HisHis咪唑基的修饰咪唑基的修饰ONNHENZCOCOOCH2CH3OCH2CH3NNENZOCOCH2CH3+pH4-7ICH2COO-pH5.5第89页/共114页第九十页，编辑于星期二：十点 十四分。 TrpTrp残基一般位于残基一般位于E E分子内部，而且比分子内部，而且比-SH-SH、-NH-NH2 2等一些亲核基等一些亲核基团的反应性差。所以一般不与常用的一些试剂反应。团的反应性差。所以一般不与常用的一些试剂反应。 N-N-溴代琥珀酰亚胺（

52、溴代琥珀酰亚胺（NBSNBS）可以修饰，并通过）可以修饰，并通过280nm280nm处光吸收的减少处光吸收的减少跟踪反应。跟踪反应。色氨酸吲哚基的修饰色氨酸吲哚基的修饰第90页/共114页第九十一页，编辑于星期二：十点 十四分。 TyrTyr的修饰包括的修饰包括-OH-OH和芳环上的取代修饰，和芳环上的取代修饰，ThrThr和和SerSer残基的残基的- -OHOH都可被酚羟基的修饰剂修饰，但反应条件严格些，生成的产物也更都可被酚羟基的修饰剂修饰，但反应条件严格些，生成的产物也更稳定。稳定。 四硝基甲烷（四硝基甲烷（TNMTNM）在温和条件下可高度专一性地硝化酚羟基）在温和条件下可高度专一性地

53、硝化酚羟基生成可电离的发色基团生成可电离的发色基团3-3-硝基酪氨酸，在酸水解条件下稳定，硝基酪氨酸，在酸水解条件下稳定，可用于氨基酸定量分析。可用于氨基酸定量分析。酪氨酸残基和脂肪族酪氨酸残基和脂肪族羟基羟基的修饰的修饰第91页/共114页第九十二页，编辑于星期二：十点 十四分。甲硫氨酸甲硫基的修饰甲硫氨酸甲硫基的修饰ENZSCH3+H2O2ENZSCH3H2O+OpH5ENZSCH3+2HCOOHOENZSCH3+OH2HCOHOO约约-10-10过甲酸过甲酸ENZSCH3+ICH2CNH2OENZS+OpH4pH4CH3CH2CNH2I-甲硫基的化学修饰甲硫基的化学修饰碘乙酰胺碘乙酰胺

54、甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件下很难选择性修饰。甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件下很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原子具有亲和性，可以用过氧化氢、过甲但是由于硫醚的硫原子具有亲和性，可以用过氧化氢、过甲酸等氧化成甲硫氨酸亚砜。酸等氧化成甲硫氨酸亚砜。第92页/共114页第九十三页，编辑于星期二：十点 十四分。（2 2）酶的化学交联）酶的化学交联 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔较近的两交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。同型双功能交联剂同型双功能交联剂:

55、 :两端具有相同的活性反应基团。可与氨基反应的两端具有相同的活性反应基团。可与氨基反应的双亚氨酸酯是一个典型的同型双功能交联剂。此外，双亚氨酸酯是一个典型的同型双功能交联剂。此外，N N羟琥珀酰羟琥珀酰亚氨酯、二硝基氟苯等。亚氨酯、二硝基氟苯等。异型双功能交联剂：异型双功能交联剂：一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用。但是用碳二亚胺时，第二个反应基团是羧基。但是用碳二亚胺时，第二个反应基团是羧基。可被光活化的高交联剂：可被光活化的高交联剂：一端与酶反应后，经光照，另一端产生一个一端与酶反应后，经光照，另一端产生一个活性反应基团（自由基）如碳烯或氮烯，它们具有

56、高反应性，没有专一活性反应基团（自由基）如碳烯或氮烯，它们具有高反应性，没有专一性。性。第93页/共114页第九十四页，编辑于星期二：十点 十四分。使用双功能试剂如戊二醛、使用双功能试剂如戊二醛、PEGPEG等可将酶蛋白分子之间等可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链之间进行共价交联，使酶、亚基之间或分子内不同肽链之间进行共价交联，使酶分子活性结构得以加固，提高其稳定性。分子活性结构得以加固，提高其稳定性。交联酶晶体技术可以大幅度提高酶的生物活性和热稳定性。并交联酶晶体技术可以大幅度提高酶的生物活性和热稳定性。并且发现交联晶体在有机溶剂中的催化活性和稳定性提高。且发现交联晶体在有机溶剂中

57、的催化活性和稳定性提高。例如，糖基化作用于交联技术联合使用应用于青霉素例如，糖基化作用于交联技术联合使用应用于青霉素G G酰化酶，利用葡聚酰化酶，利用葡聚糖二乙醛将青霉素糖二乙醛将青霉素G G酰化酶交联，酰化酶交联，55 55 下半衰期提高下半衰期提高9 9倍，倍，Vmax Vmax 不变。不变。此外，丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通过交联修饰由常温酶变此外，丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通过交联修饰由常温酶变为嗜热酶，温度从为嗜热酶，温度从45 45 提高到提高到7676第94页/共114页第九十五页，编辑于星期二：十点 十四分。对修饰剂的要求：对修饰剂的要求：修饰剂具有较大的相对分子质修饰剂具

58、有较大的相对分子质量，良好的生物相容性；分子表面有较多地反应活性基量，良好的生物相容性；分子表面有较多地反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。团及修饰后酶活的半衰期较长。（3 3）大分子结合修饰）大分子结合修饰常用的化学修饰剂常用的化学修饰剂A A、糖及糖的衍生物主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、糖及糖的衍生物主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖等；、葡聚糖等； B B、高分子聚物聚乙二醇（、高分子聚物聚乙二醇（PEGPEG）、聚乙烯醇）、聚乙烯醇 （PVAPVA）、聚）、聚N N 乙烯吡咯烷酮（乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）、聚丙烯酸（）、聚丙烯酸（PAAPAA）等；）等； C C

59、、生物大分子常用的有肝素、血浆蛋白、聚氨基酸类等；蛋白质或、生物大分子常用的有肝素、血浆蛋白、聚氨基酸类等；蛋白质或其他大分子物质等其他大分子物质等第95页/共114页第九十六页，编辑于星期二：十点 十四分。大分子多聚物与具有生物活性的大分子物质通过共价键将大分大分子多聚物与具有生物活性的大分子物质通过共价键将大分子连接到酶分子表面，使之在酶的表面形成覆盖层，从而使酶子连接到酶分子表面，使之在酶的表面形成覆盖层，从而使酶的性质产生改变。的性质产生改变。大分子在使用前要进行活化，方法有：溴化氢法、高碘酸氧化大分子在使用前要进行活化，方法有：溴化氢法、高碘酸氧化法、叠氮法、三氯均三嗪法等法、叠氮法

60、、三氯均三嗪法等NH2+酶酶NH2COOHCOOHRN=C=NRCNHOCNH 酶酶OO白蛋白与酶之间以羰二亚胺作为交联剂的修饰反应白蛋白与酶之间以羰二亚胺作为交联剂的修饰反应（修饰酶）（修饰酶）CNH 酶酶酶酶第96页/共114页第九十七页，编辑于星期二：十点 十四分。分子量在分子量在500-20 000 500-20 000 聚乙二醇类修饰剂应用最广聚乙二醇类修饰剂应用最广，其生物相容性通过，其生物相容性通过FDAFDA认证。其分子末端有两认证。其分子末端有两个能被活化的羟基。分子修饰时多采用单甲氧基个能被活化的羟基。分子修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（聚乙二醇（MPEGMPEG）MPEGM