T细胞及B细胞的分离

1、蓝色海洋书的海洋t细胞及b细胞的分离 试验中常需要从淋巴细胞群中分别出单一的t细胞或b细胞，以便更深化地讨论t,b细胞的生物学特性和功能。目前常用的分别办法有免疫磁珠分别法和免疫吸附法，近年来应用流式细胞仪可以分别出均质性的单一细胞类型或亚群。 （一）免疫磁珠法分别t细胞和b细胞【原理】用特异性抗t细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（immunomangnetic beads)，这种免疫磁珠可于磁场中结合淋巴细胞悬液中的t细胞，而未结合的b细胞和其他细胞被洗脱下来。免疫磁珠法分别细胞具有纯度高（普通为9599%）的特点。其分别效果可媲美流式细胞仪，并具有比流式细胞仪分别术经济、便利省时、容易

2、迅速等优点。【材料】1淋巴细胞悬液；2磁性激活细胞分别器（macs) macs柱（c型，可结合2x108个细胞）；3生物素标志的磁性微珠；4生物素标志的抗cd4和抗cd8单克隆抗体及生物素标志的羊抗鼠igg f(fab)2;5. macs柱染色洗涤液、macs柱洗脱液（含1牛血清清蛋白的pbs)和macs柱；fitc标志的亲和素；6培养液及试剂 rpmi 1640细胞培养液，浸湿液（含10牛血清清蛋白的pbs)。【办法】1新macs柱需高温高压灭菌，烘干后备用。将c型macs柱内分离用10ml注射器在柱下三通阀门处加入10ml macs柱浸湿液，使液面达到柱内铁丝基质平面上23cm处，关闭柱下

3、三道阀门备用。2淋巴细胞悬液（2x108/ml）离心（1500r/min,5分钟），重悬于0.15ml macs染色洗涤液中，加入生物素标志的cd4单抗和抗cd8单抗各25ul（比例为0. 05 ug/106个细胞），冰浴25分钟。用macs染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重悬于0.15m1 macs染色洗涤液中，加入50ul生物素标志的羊抗鼠igg f (fab') 2（比例为0.05 ug/106个细胞），冰浴25分钟。用macs染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重新悬浮于0.15ml macs染色洗涤液中，加入50ul fix标志的亲和素

4、（比例为0.08ug/106个细胞），冰浴孵育15分钟。用macs染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重新悬浮于0.15m1 macs染色洗涤液中，加入生物素标志的磁性微珠（比例为5ul/108个细胞），冰浴孵育510分钟。然后加入3m1 macs柱洗脱液。3将macs柱放入macs磁铁槽内，用20ml macs柱洗脱液洗柱，待液体降至柱内铁丝基质平面上23cm处，关闭三通阀门。将细胞悬液置于macs柱内。在柱下放一支50ml的试管，打开阀门，使其流速为35m1/min，边流边加macs柱洗脱液，每个柱内起码加柱洗脱液30ml。试管内的洗脱液中为cd4-cd8-细胞（即阴性分

5、别）。离心洗涤后调节细胞至所需浓度备用。【结果】将macs柱移出磁场外，用macs柱洗脱液洗柱（较大流速），则该洗脱液中为cd4-,cd8+或cd4+cd8+细胞（即阳性分别）。离心洗涤后调节细胞至所需浓度备用。为了进一步提高细胞分别纯度，可再用另外两个macs柱重复上述过柱过程并用流式细胞仪举行分析测定。【注重事项】1. macs柱用尽毕后需立刻用双蒸水冲洗整洁，再以20倍于柱体积的无菌双蒸水和5倍于柱体积的95溶液洗涤，37下烘干，高压灭菌以备再次用法。2不要将大团细胞加入柱内，以免造成阻塞进而毁坏macs柱。3洗脱macs柱时，流速越慢则分别细胞的纯度越高。在macs柱上加入液体时不要产

6、愤怒泡。4在分别洗脱时，柱内液体不要低于柱内的铁丝基质平面以下，即始终让铁丝基质内含有液体，否则细胞分别将彻低失败。5假如分选的细胞还需要举行培养，全部的器材和液体均应无菌。macs分别过程应在超净工作台内完成操作。（二）用尼龙毛柱分别t细胞和b细胞【材料】尼龙毛柱的制备（注重无菌操作）：1取直径3d，长度约10cm的尼龙毛（聚酞胺纤维），用0.2mo1/l hcl浸泡过夜，用双蒸水洗净hcl，置37烘干备用。2称取50mg尼龙毛，匀称簇拥后置hanks液中浸泡。取1 ml注射器，出口接塑料管并夹住，将尼龙毛匀称填塞入注射器中，排净空气，柱高56cm。此柱可分别约2x107细胞。【办法】1取p

7、bmc，用含10的rpmi 164。培养液将细胞配成2x107/0.5ml。2用5 ml预温至37的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。将0.5 ml上述pbmc悬液加入尼龙毛柱中。待细胞悬液所有进入尼龙毛柱后，立刻加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管。3在37,5% co2培养箱中培养1小时，使细胞与尼龙毛充分黏附，用5 ml预温至37的细胞培养液洗脱尼龙毛柱，洗脱液中含有纯的t细胞，1000r/min离心洗脱液10分钟，去上清液，再用细胞培养液洗涤细胞并计数，用细胞培养液将细胞配成适当浓度。用力反复挤压尼龙柱，挤出黏附在尼龙柱上的b细胞，并用少量的rpmi 1640培基洗脱，此细胞悬液含有丰盛的b细胞。

8、【结果】如此得到的t细胞纯度在90以上，b细胞纯度可达80%。【注重事项】1基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度，事实上，收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集，由于即使收集更多的量，回收率几乎不会增强。2尼龙毛采纳辐射灭菌。（三）流式细胞仪分别t细胞和b细胞【原理】流式细胞仪（flow cytometry,fcm）主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流淌系统，细胞排成单行，逐个流经检测区举行测定。当细胞从流淌室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的匀称小滴（40000个秒），每小滴内最多含一个细胞（其中惟独百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照耀产生荧光和散射光，由光

9、电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，辨别细胞的类型。如识别的是预计所需的细胞时（如t细胞、b细胞），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管。本法分别细胞精确迅速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下举行。【材料】1. rpmi 1640培养基应采购不含的，用法时加入5的。2. fitc-抗cd3单克隆抗体fitc为异硫氰酸荧光素，cd3为t细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）。【办法】1用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分别单个核细胞，用rpmi 1640培养基配成1x107/ml。2加适量fitc-抗cd3,4孵育30分钟，用rpmi 1640培养基洗2次。