实验七鸡基因组的PCRRFLP分析

1、实验七实验七 鸡基因组的鸡基因组的PCR-RFLP分析分析动物遗传学实验动物遗传学实验一、实验方法一、实验方法1、鸡基因组、鸡基因组DNA的提取的提取2、目的基因的、目的基因的PCR扩增扩增3、内切酶消化、内切酶消化PCR产物产物4、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）鸡鸡DNA的获取的获取 1、鸡翅下静脉采集全血；、鸡翅下静脉采集全血；2%EDTA抗凝；抗凝； 2、DNA提取：提取： 裂解细胞核（红细胞裂解细胞核（红细胞+白细胞）白细胞）酚酚-氯仿去除蛋白质氯仿去除蛋白质酶解酶解RNA获取获取DNAPCR扩增扩增1、引物设计（、引物设计（Genbank）；）； 2、聚合

2、酶链反应（、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）PCR反应体系反应体系 DNA模板模板 dNTP Taq DNA聚合酶聚合酶 引物引物 Mg2+ 缓冲液缓冲液PCR反应程序反应程序预变性预变性 94 35min35循环：循环： 变性变性 94 30s1min 退火退火 5065 3060s 延伸延伸 72 12min 后延伸后延伸 72 510minPCR产物电泳检测结果产物电泳检测结果 PCR产物产物+缓冲液缓冲液+内切酶内切酶 5-TCATGA-3 3-AGTACT-5内切酶消化内切酶消化PCR产物产物A BAABB AB 电泳检测基因（电泳检测基因（

3、1）电泳检测基因（电泳检测基因（2） 实际操作环节实际操作环节琼脂糖凝胶电泳检测基因型琼脂糖凝胶电泳检测基因型二、实验原理二、实验原理 电荷效应：电荷效应：DNA分子在高于其等电点的分子在高于其等电点的pH溶液中带溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。负电荷，在电场中向正极移动。分子筛效应：与分子大小及构象有关，由于分子筛效应：与分子大小及构象有关，由于DNA分分子或子或DNA片段的分子量差别，电泳后呈现迁移位置片段的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。的差异。条带类型对应于基因型。条带类型对应于基因型。三、实验目的三、实验目的 通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电

4、泳技术、泳技术、DNA的分离鉴定及基因型判的分离鉴定及基因型判定方法。定方法。四、实验材料、仪器和试剂四、实验材料、仪器和试剂材料：材料：DNA样品样品仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、紫外透射仪、紫外透射仪、Tip头头试剂试剂 电泳缓冲液电泳缓冲液(1TAE)：0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷-乙乙酸酸(tris-乙酸乙酸)，0.01mol/L乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 溴化乙锭溴化乙锭(EB10mg/ml)：100ml灭菌双蒸水中加入灭菌双蒸水中加入1g EB 1%琼脂糖：琼脂糖：100ml 1TAE加入加入1g

5、琼脂糖琼脂糖 上样缓冲液上样缓冲液(溴酚蓝溴酚蓝-甘油溶液甘油溶液)：先配制：先配制1%的溴酚蓝水溶的溴酚蓝水溶液与等体积的甘油即可液与等体积的甘油即可五、实验步骤五、实验步骤(一一)制胶制胶1.将将1.0g琼脂糖加至琼脂糖加至100 ml 1TAE缓冲液中，配成缓冲液中，配成1%琼脂糖。琼脂糖。琼脂糖在微波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至琼脂糖在微波炉中加热熔化。灌胶前将琼脂糖冷却至60。C以下。以下。2.加入加入5ul溴化乙锭（终浓度溴化乙锭（终浓度0.5ug/ ml ）至熔化的琼脂糖液中）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。混匀，但避免出现气泡。3.准备好凝胶成型器。准备好凝胶成型

6、器。4.将冷却的琼脂糖倾入用凝胶成型器，制备凝胶。将冷却的琼脂糖倾入用凝胶成型器，制备凝胶。5.在凝胶一侧放入成型梳，将梳子夹在胶上方的桥上，并保证在凝胶一侧放入成型梳，将梳子夹在胶上方的桥上，并保证梳齿在塑料板稍上一点，但不要接触塑料板。梳齿在塑料板稍上一点，但不要接触塑料板。6.待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），轻轻去分钟），轻轻去除梳子。配制除梳子。配制2L 1TAE缓冲液，用于电泳槽。将缓冲液到缓冲液，用于电泳槽。将缓冲液到入洁净的凝胶槽。入洁净的凝胶槽。（二）电泳（二）电泳1.将凝胶塑料板水平放置在电泳槽中。将凝胶塑料板水平放置在电泳

7、槽中。2.凝胶应完全侵入缓冲液，但覆盖的缓冲液不要超过凝胶应完全侵入缓冲液，但覆盖的缓冲液不要超过1cm。3.取取5ul样品加入上样缓冲液，小心的将样品加入每一样品槽内样品加入上样缓冲液，小心的将样品加入每一样品槽内4.接通电源，电压接通电源，电压4-5V/cm，DNA从负极移到正极。时间从负极移到正极。时间30-40分钟。分钟。5.关掉电源，结束电泳。关掉电源，结束电泳。1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间2.开通紫外光，在电脑中观察图像；开通紫外光，在电脑中观察图像；3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；4.根据图像结果判定不同个体基因型。根据图像结果判定不同个体基因型。六、结果分析六、结果分析 七、作业七、作业 1.记录实验结果记录实验结果 2.实验心得实验心得 3.鸡生长激素基因