优硕论文培优申请书

1、广东医学院2015年度拟培育优秀硕士论文申报书论文名称双功能药物载体的设计及装载抗肿瘤药物的基础研究所在学科药剂学导师姓名李宝红年 级13级研究生姓名联系电话电子邮箱论文名称双功能药物载体的设计及装载抗肿瘤药物的基础研究一、项目摘要 （400字以内）药物的靶向传输和控释是目前药物载体面临的新挑战。金属-有机骨架材料（MOFs）具有较高的比表面积、孔径及孔道内环境可调等特性，在药物载体领域展现出诱人前景，但目前大多MOFs材料的生物兼容性、水溶液稳定性等问题，严重制约其快速发展。本项目拟通过药物分子（如阿魏酸）前驱体的设计并制备出新型MOFs材料，以解决材料的生理安全性和水溶液稳定性等关键问题。

2、在MOFs材料各类表征、药理毒性试验以及理论分子模拟的基础上，进行体外及动物体内的药物负载-缓释研究，探索所合成材料的孔极性、孔径大小和孔隙率等对药物载入量和缓释性能的影响，阐明材料的药物控释机理，为开发新型高效的药物载体提供实验基础。二、研究意义、国内外研究现状及创新之处（限2000字）研究意义近几年，Férey和Horcajada等人对MOFs作为新型的药物载体及其负载的机理进行了探讨，这些研究结果表明MOFs材料可以同时实现高载药量和适宜的药物控制释放。例如：在 MIL-100中载入药物布洛芬分子，载药量可达0.220g/g，药物18天才释放完全。因此MOFs材料为开发新型高效

3、的药物缓释载体提供了新方法和新思路。MOFs作为药物负载-缓释生物材料，有关其生理安全和水溶液稳定性关键问题没有得到很好的解决。为了克服MOFs作为药物载体的缺陷，本项目拟将药物分子有机配体引入到MOFs材料制备的体系中，实现材料的生理安全性和水溶液稳定性，深入探索载体对药物的负载-缓释的作用机理，为开发新型高效具有实用意义的药物载体提供新的思路和理论依据。国内外研究现状及发展动态分析当前现代医药的发展非常迅速，治疗技术已经深入到达分子和基因层次，但是很多较差溶解性的药物或是治疗基因片段由于没有合适的载体，不能有效到达目标区域，导致不能很好的在体内发挥作用，其应用受到很大的限制。药物缓释载体的

4、出现，为药物治疗过程中碰到的问题提供了解决新方案。其主要的优点在于能够减少给药次数降低毒副作用，增加药物治疗稳定性和延长药物作用时间提高药物疗效等。目前载体大体分为两种：有机载体和无机载体。已报道的用于药物缓释的载体材料主要包括两类：一种是有机材料，主要包括具有生物相容性的大分子或聚合物；另外一种是无机材料，如沸石和介孔硅酸盐材料等。这两种材料各有优缺点：有机材料缺乏明确的孔隙率而无法准确的控制药物的释放速率；而无机材料中通过在孔壁上植入有机分子调节释放，但药物负载量却下降。相比上述两种药物载体材料，MOFs 材料作为新型的药物载体具有更独特的特性：孔径大、比表面积大、孔道内表面可调控、药理毒

5、性低、载药负载量高且易于对药物缓释控制。2009 年，Horcajada 等研究了一系列的多孔羧酸盐金属有机骨架 MOFs 装载具有不同极性、大小和官能团的药物分子，研究表明，负载药物后的材料具有良好的抗 HIV 生物活性。虽然多孔有机聚合物的研究在药物缓释领域还处于基础阶段，但鉴于它独特的优点，将在生物医药领域有着广泛的应用前景。现在许多药物通过金属离子激活和生物传输,也可以与金属离子作用生成金属配合物具有改良药理和毒理性质。阿魏酸(Ferulic Acid)的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸（又称肉桂酸，3苯基2丙烯酸，分子结构）的衍生物之一。阿魏酸（阿魏酸钠）具有抗血小板聚

6、集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素a2（txa2）的生成，增强前列腺素活性，镇痛，缓解血管痉挛等作用。是生产用于治疗心脑血管疾病及白细胞减少等症药品的基本原料。如心血康、利脉胶囊、太太口服液等等，它同时在人体中可起到健美和保护皮肤的作用。尽管阿魏酸及其衍生物具有潜在的配位能力，但是，使用阿魏酸作为配体构建金属-药物载体仍然处于萌芽阶段，故对此的研究是充满挑选且具有重要的意义。本项目的选题思路最近，我们采用微波辅助溶剂热法制备出了 Bio-MOF纳米材料，研究了它对抗肿瘤药物5-FU负载-缓释行为。此研究工作为本项目的开展奠定了一定的基础（详情见已经取得的研究成果）。基于上述对国内外

7、研究进展的分析和前期工作的探索，本项目拟从药物-金属材料结构的形成特点出发，先利用生物小分子药物（如阿魏酸）和人体必需微量金属元素组装出簇基的材料 (如图1)，解决MOFs材料生理安全性和水相不稳定性的关键问题；在此基础上，同时针对抗肿瘤药物的特点，选择不同类型的纳米MOFs材料，分别进行模拟体液和动物体内的药物负载和缓释研究。从理论和实验相结合的角度探索纳米材料的合成方法、结构特征、物化性质及其与药物负载-缓释的内在关联，揭示和分析其机理，总结其中规律，为开发新型高效的金属有机药物负载-缓释提供理论依据。图1 拟开展载体合成和药物负载-缓释示意图本项目的特色与创新之处本项目具有材料化学、药物

8、化学和药剂学多学科交叉的特点。(1) 以“生物小分子-金属簇基”作为结构设计单元，在环境友好的条件下制备出的纳米MOFs材料解决了生物兼容性和稳定性等问题，该思路是本项目的创新之处。（2）结合计算机理论模拟，从分子水平研究有机配体修饰基团属性对药物分子负载量和缓释性能的构效关系，这是本研究项目的另外一个创新之处。三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标a) 采用常规方法合成出药物-金属驱体，通过在反应体系中引入桥联共轭结构特征的羧基配体制备出孔结构优异的MOFs化合物，实现材料的高稳定性和优良的生物兼容性以及给药途径的多样化。b) 掌握MOFs纳米材料的合成规律，探讨材料孔道属性对药物

9、分子负载量和缓释性能的构效关系，阐明MOFs材料的药物缓释机理，建立材料中药物释放的简单动力学模型，为设计具有高载药性和可控缓释时间的药物载体提供理论依据和实践指导。研究内容A、金属-药物MOFs纳米材料的构筑首选选择生物小分子（如阿魏酸等）以及人体必需微量金属元素（如Fe3+, Zn2+等）等定向组装成生物小分子-金属簇基；同时设计并合成出具有不同非配位官能团的刚性和柔性芳香羧酸有机配体，通过改变侧链官能团的属性以修饰MOFs材料孔道属性，影响客体药物分子与主体骨架材料孔道间的相互作用，进而影响药物分子缓释能力；同时侧链取代基的引入能有效提高MOFs材料的水溶液稳定性；采用红外吸收光谱、热重

10、分析、元素分析和X-射线粉末衍射初步判断材料的结构特征；采用X-射线单晶衍射确定MOF材料的晶体结构，获取结构特征；采用N2的物理吸-脱等温线获取MOF结构的比表面积、孔径、孔体积等信息。B、药物载体中药物吸附及扩散的计算机理论模拟利用计算机理论模拟探讨不同类型材料与药物分子间的相互作用，同时模拟其在体内的控制-释放情况，为研究药物缓释机理提供信息支撑，包括利用巨正则系综蒙特卡罗(GCMC)模拟计算影响药物载体吸附量大小的主要因素(孔径、孔隙率和比表面积)，以及有机配体侧链官能团对药物分子吸附量的影响，从而反馈指导设计合成和改进结构材料；利用平衡动力学(EMD)模拟推测药物分子在药物载体结构内

11、部运动的自由程度，如自扩散系数越小，说明药物载体吸附量越小，相对应的孔径、孔隙率和比表面积理论上也越小。相近孔径、孔隙率和比表面积，结构属性不同(刚性和柔性)的材料，对药物分子吸附量的大小也可通过自扩散系数反映；利用密度泛函理论(DFT)模拟计算有机配体侧链基团属性(供电子或吸电子基团) 对药物分子吸附作用力的影响，从而可通过改变取代基属性来调控与药物分子间相互作用力，确定药物分子在材料孔道内的最佳吸附位置。C、药物载体的药理毒性和稳定性实验药理毒性：考察药物载体对肝癌细胞，肺癌细胞，正常细胞等的药理毒性，从而确定其是否生理安全；评价材料在不同剂量条件下对正常小鼠进行连续3-6个月的急性毒性实

12、验，并且了解其潜在的毒性靶器官。稳定性测试：以大鼠血浆为稳定性实验的环境，考察血浆中含药物载体在不同温度下(37和40°C)及不同时间段的稳定性，经分离出来的药物载体，采用热重分析，X-射线粉末衍射等表征手段判断药物载体的稳定性。D、药物载体的负载-缓释实验药物载体的负载实验：采用冻干-复溶法负载药物分子，考察药物载体与药物分子用量比例对负载量的影响；采用紫外-可见分光光度法、HPLC、热重分析(TGA)、元素分析等多重手段来确定药物负载量。药物在模拟体液中的缓释实验接着称量一定量的载有药物分子的药物载体置于500mL模拟体液(Simulated body fluid, SBF)的烧

13、杯中，在保持37°C下，进行适当的磁力搅拌，定时取样通过紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法测定溶液中药物分子的含量。药物在动物体(大鼠)内的缓释实验通过紫外-可见分光光度法制备药物分子在模拟体液不同浓度下的标准曲线考察药物缓释实验；通过高效液相色谱法确定药物分子的保留时间，考察药物缓释实验以及药物载体的稳定性；测定SD大鼠单次静脉注射药物载体后其体内经时血药浓度变化，绘制药时浓度变化曲线，表征药物载体在血液中的经时变化规律，确定药物的缓释效果。拟解决的关键问题1) 如何通过调控获得结构独特的纳米MOFs材料，这是本项目拟解决的一个关键问题。2) 如何实现药物的高包封率和较好的缓释性

14、能，通过实验数据和理论结合的方法，从分子水平探索材料内孔道与药物分子之间的缓释机理，是本项目拟解决的另外一个问题。四、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析技术路线A、金属-药物MOFs纳米材料的构筑和表征采用红外光谱、热重分析(TG-DSC/TG-DTA)、元素分析以及X-射线粉末衍射结果初步判断材料是否为MOFs材料以及获得材料热稳定性的基本信息；经初步表征结果，采用X-射线单晶衍射表征手段，获得材料的详细结构信息以及初步计算出孔径大小和了解结构特性；通过77 K条件下材料的N2物理吸附-脱附等温线数据，了解材料的比表面积、孔径和孔体积大小，确定具有潜在研究价值的目标MOFs纳米

15、材料。B、药物载体中药物吸附及扩散的计算机理论模拟利用巨正则系综蒙特卡罗(GCMC)模拟：基于MOFs材料的结构特点(晶胞)而选择盒子大小，在模拟盒子的三维方向上采用周期性边界条件和最小影像原理。对于静电势能中的长程作用力采用Ewald加和法计算。在采用GCMC方法进行药物分子吸附时，考虑到计算机资源，模拟的总步数为2.2 × 105，前1 × 104步数用于结构松弛，然后再用1 × 104步数使体系达到平衡，最后2 × 105步用于热力学统计计算。每次运行都借助10个组块来估算统计热力学的不确定性，并且从组块的平均来计算标准偏差，使每次模拟的标准偏差控

16、制在10%以内。C、药物载体的药理毒性和稳定性实验药物载体的药理毒性：细胞MTT法： 取对数生成期的PC12细胞以1×105cell/L接种于96孔板，每孔100L, 与37°C、5%CO2培养箱中培养24h, 分别加入不同种浓度(如：0g/mL, 5g/mL, 10g/mL, 20g/mL) 载体材料预处理2-4h,每孔加入MTT(5 mg/mL)20 ul,继续培养4h, 吸除上层液体，每孔加入DMSO 100L, 于37°C培养箱15 min，待蓝紫色结晶物完全溶解后，酶标仪检测各细胞在490 nm下的吸光值，代表细胞活力。细胞存活率(%) = 各组吸光值/

17、正常对照组吸光值×100%，通过测试细胞存活率来分析药物载体的药理毒性。药物载体动物体内的稳定性，步骤如下：空白血浆制备：周龄为8周的SPF级健康雄性SD大鼠，体重约为250 g，大鼠经腹腔注射巴比妥钠麻醉并固定，经腹主动脉取血；全血置于自制EDTA抗凝血管抗凝并高速离心(10000 rpm) 15 min，取其上清血浆于-80 °C冰柜保存待用；药物载体贮备液的配制：精密称取50 mg的药物载体，溶于5 mL有机溶剂中，制成10 mg/mL 贮备液，储存于-20 °C；含药物载体血浆制备：取适量药物载体贮备液，加入到200 L 定量的空白血浆中，旋涡后制成一定浓

18、度的含药物载体血浆，并迅速储存于-80 °C，待用；药物载体稳定性研究：将(3)制备的血浆分别置于人体正常体温37 °C 和40 °C下考察不同时间内的稳定性，基于药物载体的性质，采用液-液萃取或直接过滤等方法，分离出药物载体，采用热重分析(TG-DTA/TG-DSC)，X-射线粉末衍射，核磁共振(C13和H1)和XPS能谱等表征技术判断药物载体的稳定性。D、药物载体的负载-缓释实验药物载体的负载实验采用冻干-复溶法负载药物分子：将前期得到的化合物进行预处理(如抽真空除去客体分子)，把处理好的MOFs化合物和被运载的药物混合在生理盐水中，定容；然后利用超声波细胞粉

19、碎机进行超声分散；继而用-80°C冰箱进行预冻后放置于冻干机进行冻干；最后将样品复溶，离心后取上清进样，利用HPLC测定其包封率。载体和药物分子的质量比主要影响材料对药物的负载量，因此，需要不断摸索药物负载实验的最佳条件，使载体负载量达到最佳值。此外，可以通过XRD来证实药物吸附前、吸附以后和药物释放以后骨架的稳定性。药物负载量的计算：本项目研究中，拟先采用紫外-可见分光光度法测定负载前药物溶液的浓度，完成药物负载后，再测定药物溶液的浓度，两者的差值即为药物负载量；接着通过热重分析(TGA)，元素分析，X-射线荧光光谱仪进一步确定药物负载量；通过77K条件下的N2物理吸-脱附等温线判

20、断药物载体是否负载完全；采用傅里叶红外光谱、X-射线粉末衍射和透视电镜表征药物载体负载药物后的化学性质和物象变化(孔道是否填充了药物分子)；此外，通过比较药物分子未负载前以及被负载后的固体核磁共振(C13和H1)谱图，间接了解药物分子与药物载体孔道之间可能存在的各种作用力。药物缓释实验(1) 药物在模拟体液中的缓释实验标准曲线的制作：基于紫外-可见分光光度法，制备药物分子在模拟体液(SBF)不同浓度下的标准曲线；基于高效液相色谱法，得出标准药物分子的保留时间；缓释实验：接着称量一定量的载有药物分子的药物载体置于500mL模拟体液(Simulated body fluid, SBF)的烧杯中，在

21、保持37°C下，进行适当的磁力搅拌，定时取样通过紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法测定溶液中药物分子的含量。在药物释放率测定的实验过程中，每次取出混合液进行测定的同时要及时加入等量的模拟体液以保证体系总量的恒定。采用高效液相色谱法表征释放体系中的药物分子的同时，还能够检查到构筑药物载体的生物小分子和芳香羧酸有机配体等组成成分，从而检测药物载体的稳定性。(2) 药物在动物体(大鼠)内的缓释实验在建立上述药物载体在血浆中稳定性的分析方法基础上，将其运用于测定SD大鼠单次静脉注射药物载体后其体内经时血药浓度变化，并绘制药时浓度变化曲线，以表征药物载体在血液中的经时变化规律。可行性分析a) 课题设计的可行性本研究从生物小分子和人体必需微量金属元素的选择，MOFs纳米材料的合成以及材料的试验和血浆中稳定性实验、对药物的负载及其在模拟体液和动物体内中的药物缓释能力的整个技术路线和构筑方法上是可行的。研究中所采用的研究方法为通用的结构测定、物性测量的实验和理论方法，且方法成熟，理论和实验技术既可行又可靠。b) 实验条件实验室具备合成和分析所需的各种仪器设备，具有化学合成中心实验室，新建的GM