最详细的Western_Blot过程步骤详解

1、Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western免疫印迹(Western Blot )是将蛋白质转移到膜上，然 后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：一、 原理二、 分类i.放射白显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、 主要试剂四、 主要步骤五、 实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5. Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的

2、常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、 原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用 的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白 质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记 的第二抗体起反应，经过底物显色或放射白显影以检测电泳分离的特 异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的 表达。二、

3、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条 件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使 胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、 丙烯酰胺和N, N-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙 稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N , N-亚 甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g , N , N-亚甲叉双丙稀酰胺1g ,加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4 C避光保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以

4、发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS , 1mlH2O去离子 水配制，室温保存。3、 分离胶缓冲液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。4、 浓缩胶缓冲液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tr

5、is碱制备，再 用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液N, N , NN四甲基乙二胺催化过硫酸铉形成白 由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的白由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液：pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,筑基乙醇3.2ml, 0.05%漠酚蓝1.6ml, H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一般为 20-25ul，总蛋白量

6、100四。7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：30.3gTris , 188g甘氨酸，10gSDS，用 蒸馆水溶解至1000ml,得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲 液。临用前稀释10倍。8、 转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。9、丽春红染液储存液： 丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使 用后应予以废弃。10、 脱脂奶粉5%(w/v)。11、NaN3 0.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶 液

7、(PBS)。12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5), 500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 过氧化物酶标记的第二抗体。15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、100mmol/L NaCl。19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5) , 5mmol/L EDTA。(可以参看分子克隆)四、主要步骤 主要包括以下4个基本步骤1.样品制备原

8、始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方 法参阅相关文献。1.培养细胞或药物处理。2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。3.加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 /w或75 cm2plate,500-1000 W瓶)，舌【J落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。4.超声1015秒剪切DNA以减低样品粘性。5.煮沸样品5 minutes。6.离心12000g, 5 min ,取上清。乙 电泳分离：上样15 M20 M至SDS-PAGE胶(10 cm x 10 cm)电泳。如

9、要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/ 100 mm dish/ 150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀415min , 14000g离心15min ( 4C),弃沉淀，用 Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以 调整上样体积和上样量，进行 Western杂交时还需设置内或外参照,通常用beta-actin。注意：一般上样2030昭已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加 大上样量至100四，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更 敏感的检测方法。2.电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）3.

10、转膜杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方 案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和 规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转 移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而 高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白 还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越 牢固。通常用0.45叩和0.2叩两种规格的NC膜。大于20kD的蛋 白可用

11、0.45 gm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2叩的膜了，如用0.45 的膜就会发生flowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。蛋白质常用的转移方法主要有两种： 槽式湿转和半干转移。前者操作 容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。1.将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡

12、饱和3-5秒钟。3.装配转移三明治：海绵？3层滤纸？胶？膜？3层滤纸？海绵，每层 放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V , 1h（电流约为0.3A）。注意：应再次 检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。5.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜4.免疫杂交与显色1.用25 ml TBS洗膜5min ,室温，摇动。2.置膜于25 ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动3.15ml TBS/T洗3次（5 min/T）4.加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4C过夜，缓慢摇动。5.15 ml TBS

13、/T洗3次（5 min/T）。6.加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标 记的二抗，室温孵育1h,缓慢摇动。乙15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。8.15 ml TBS洗1次。9.蛋白检测（显色法或发光法，按相应试剂说明操作）。注意事项：1.操作中戴手套，不要用手触膜。2.PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。3.如检测小于20kD的蛋白应用0.2叩的膜，并可省略转移时的平 衡步骤。4.某些抗原和抗体可被Tween-20洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。5.关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS:能和某些抗原相互 作用，掩盖抗体

14、结合能力；0.33% BSA in PBS:低的内源性交叉反 应性。6.如用0.1% Tween 20、0.02% NaN3in PBS or TBS作封闭剂和 抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。五、实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）:1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：抗体技术实验指南和Antibodies （a laboratory manual , wrote by EdHarlow , david lane ）两本书不错。2.针对样品的常见问题B.做线粒体膜UCP

15、2蛋白的Western Blot（以下简写成WesternBlot）,提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一 抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120四，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？ 解答：怀疑是样品问题，可能是：1,样品不能反复冻融；2,样品未 加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓 度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多 加几中种蛋白酶抑制剂。E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？ 解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

16、F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？ 解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时 最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经 常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔 所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流 延长时间，多加5 10%甲醇。H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度 多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？解答：260k

17、d的蛋白不好做，分离胶用6%, Stacking Gel 3.5 %I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分 子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。J.蛋白变性后可以存放多久？解答：80 C,一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解 掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。K.我所测定的蛋白分子量是105KD， 按理说分离胶应当采用7.5%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11 %的

18、配方，不知为 何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用， 因为105 KD的蛋白在上 述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。L.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体， 三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作 调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲 和素生物素的生成， 是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用B S A代替 应该好一点.M.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：Western Blot一般上样30 100微克不等，结果跟目的蛋白 的丰度、上样量、一二抗的量

19、和抚育时间都有关系，也与显色时间长 短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一 点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好 的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。N.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心 要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分 步抽提（超速离心） 。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注

20、意抑制蛋白酶的活性（加入PMS F和蛋白酶抑制剂cocktail）,封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择。O.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择7% 的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则 出现杂带不知道如何分析）。P.有什么方法可以提高上样量？解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。Q.我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取 可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的 提到膜

21、蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以 了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd不算大， 也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答： 上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关 系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3四/mm2。S.一抗，二抗的比例是否重要？解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异

22、的 本底。3.抗体 做细胞信号传导， 要做磷酸化某因子WesternBlot ,其二抗有何要 求？解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标 记的二抗。U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂 盒显色。转膜过夜， 一抗孵育也是过夜的， 若封闭也过夜的话就要四 天才看的到结果了。解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是 不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜 的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦， 何必浪费时间呢。至于具体的 转膜时间，还要看你的目的蛋白分

23、子量的大小；转膜的设备，是半干 式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可 以一抗1:1500 ;二抗1: 20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几 次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min ,跑一张好膜不容 易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！V.免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变

24、 性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空 间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连 续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组 化和Western ,而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）W. Western Blot中抗体的重复应用问题解答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵， 可反复使用2 3次。稀释后应在2 3天内使用，4度保存，避免反 复冻融。4.滤纸、胶和膜的问题X. NC膜 PVDF膜尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持

25、物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480 - 600g/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80 100四/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不 强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125 300四/cm2。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分密 嚏碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结 合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较

26、脆，易破碎；PVDF膜较 强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经 碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复 使用。Y.在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基 团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合， 做小分子的蛋白转移时多加 甲醇也是这个目的。乙检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？ 解答：可以。AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样 空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间

27、和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可 以让磷酸化酶失活。CC.采用tank system有什么讲究?解答：建议低电压，长时间，（一般tank System用衡压好点），如28V 14 16hrs。DD.做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和IHC。EE.膜一般要如何处理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF.如果是6 X8转印膜，要加多少一抗？解答：

28、一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是 那么大的膜孵育体积一般最少为3 5ml。GG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。解答：无要求。HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对 吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包 起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸 发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题， 你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。II.膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：如果是用的是半干转，顺序为：

29、阴极一滤纸一胶一膜一 滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1 2mm，而膜的长宽分别比胶大1 -2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短 路，电流不会通过胶和滤纸。JJ.蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD ,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗？解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12 %SDS-PAge ,湿转36V , 3 5hrs就可以了， 可以根据你实 验室的经验调节；170kd用7%SDS page , 48V 10hrs 16hrs。KK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？解答：可以考虑：转移缓冲液中加

30、入20%甲醇（是指终浓度）（优化 的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册），因为甲醇可降低蛋 白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止 凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间； 转移缓冲液加入 终浓度0.1%SDS ,也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使 用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压/电流；增加 转移时间。LL.如何选择最合适的蛋白杂交膜？解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重 要环节。根据杂交方案、被

31、转移生物大分子的特性以及分子大小等等 因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合 理的选择。硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维 素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异 性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合 的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不 同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量 蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm,蛋白的转移

32、就很难进行了。因此，我们通常用0.45叩 和0.2叩 两种规格的硝酸纤 维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45叩 的膜，小于20kD的蛋 白就要用0.2叩的膜了，如果用0.45顷的膜就会发生“Blowthro昭h的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合 的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度 有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素， 保证了最大的蛋白结合量，可达80-150昭/cm2。由于100%的纯度, 因而也大大减少了非特异性的结合， 降低杂交背景，无需

33、高严谨度的 洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸 纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制 造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合 蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为 蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样， 可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲

34、和力在精细工艺下比常规的膜都 要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必 需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白 的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以 作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团， 包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带 电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45孔径的DEAE膜，除了

35、可以做Western Blotting夕卜，还可以用于核酸结合研究。还有一种离子交换型膜是愈甲基(CM)修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸 系列分析或微测序。5. Marker的相关疑问MM.我用的是可视marker (BIO_RAD ),但是电泳总跑不全8条带, 请问什么原因？怎样改善？胶用过8%, 10%, 12%，都是这样。marker是新买的。解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电 泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。NN.用的是Roche mo

36、lecular Biochemicals公司的由100kd , 75kd , 45kd , 30kd ,20kd , 10kd组成的marker。开始做Western Blot时 还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一 条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋 白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法， 而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP )。

37、但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点!解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd , 75kd ,45kd , 30kd , 20kd , 10kd组成的markero开始做Western Blot时还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候,Prestained Marker放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。2、 “前几次做WesternBlot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方 法也仅能看到marker有一条大约是

38、30KD的条带出现。”转移时半干 法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。3、 “再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP )。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你要做这么 大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。6.染色的选择OO. Western Blot哪种染色好？解答：(1)阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5四，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱 色慢，背景局。丽春红S和快绿在检测后容易

39、从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。(2)胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。(3)生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。7.参照的疑问PP.是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。QQ.用BANDSCAN分析结果行吗？解答：分析一般的结果没问题。RR.核内抗原Western Blot内参选择什么合适？解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很 多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参

40、。SS.转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2 ,一般1小时左右？解答：不是的，半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT.做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin ,GAPDH ,那个好？解答：选用beta-actin就可以。8.缓冲液配方的常见问题UU.转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris - HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。VV.准备做大鼠脑子的Western Blot,蛋白质位

41、于细胞核中，请问此 蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白 质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷 酸化。WW.想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不 受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。XX.最近作了两次Western Blot,不但没阳性结果，显色背景都没有， 电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD-分子量67kd

42、 ,提取液有蔗糖，其余同三去污 裂解液。蔗糖不会有影响把？样本-20度放置一周内测。2、一抗放 置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背 景都没有把？ 3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均 匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST,漂洗液用的是含 1%BSA 的 TBST 液，TWEEN-20 为0.1% ,不会是 封闭液的问题吧?解答：可以在下面几个问题上找找原因。1.封闭液用5%Milk,漂洗 液(washingbuffer用TBST) 2.看看一抗是否能work,降到1： 20。3.看看二抗是否有问题。YY.加甲醇的目的是什么？解

43、答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特 别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。ZZ.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”， 其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？解答：是Tween，配方如下：Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve8.8g of NaCl , 0.2g of KCl , and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with H

44、Cl, Add distilled H2O to 1L,Sterilize by autoclaving.AAA.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就 在室温里做，或者要在4度下？解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行 一个小时，然后4度过夜。BBB.实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫月尿提 取膜蛋白吗？配方如下：7M尿素，2M硫月尿，Triton-x-1000.2ml ,新鲜加入：65mM DTT蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%（v/v）是用于抽提双向电泳用蛋白的

45、配方。 不止用于抽提细胞全蛋白（主要 是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解缓冲液（Tris.HCl , 50 mmol/L , pH 7.5; NaCl , 150 mmol/L;NP-40 , 1%;脱氧胆酸钠，0.5%; SDS , 0.1%; EDTA , 1 mmol/L; PMSF , 1 mmol/L;Leupeptin , 2四/ml）不知对于膜蛋白 效果如何？此外该方中的EDTA ,是否用做蛋白酶抑制剂？ 解答：做2 D绝对不推荐使用NP-4 0（因为即使进口的NP- 4 0也不纯，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋 白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌

46、等），可以不使用cocktail ,因为7M尿素+2 M硫月尿+4 %CH AP S构成的变性环境已经足 以抑制大部分蛋白酶的活性，2 M硫月尿+4 %CH AP S对于抽提膜 蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。 此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。EDTA用于灭活金属蛋白酶（主要是其鳌合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以 导致蛋白质的修饰，做WB无所谓，做MAILD I时会给正确鉴定 带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质（在2-D裂解缓冲液中，两 性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质 的溶解性；还可以去除一部分核酸）；也不推荐采用S

47、DS，因SDS会 与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下METHOD2(50ml总量)：？-mercaptoethanol 342底20% SDS 5 ml ; Tris-Cl pH 6.7 3.125ml;力口ddH2O至50 ml。方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50 C水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此 时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul2、10%SDS 1ml3、tris (

48、0.5M , pH6.7) 625ul4、dH2O 3.34ml50 -55 C , 30min。METHOD4stripping buffer应该是可以放置很久的。不过我习惯于现配- 毕竟，加了6-mercaptoethanol以后太难闻了，配了就用；而且，有了 现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，现配还是很方便的。每次用 量5ml少了点，我每次用50ml。METHOD5 0.5M NaCl , 0.5M HAc ;室温摇床15min。METHOD6将用过的膜泡在1*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然 后封闭，加一抗，二抗（同第一次发光），实践证明方法完全可行。不管用那种

49、方法，洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次。9.条件的摸索DDD.用的是SantaCruz的抗体， 也实验过一抗和二抗肯定能结合， 二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是 不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分 别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分 子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污 剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解-80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，取上清，与分子克隆 （第二版）上的加样buffer混合，沸水变隹5分钟，上样。不知道是 哪里出了问题？

50、 解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司 的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。2、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度， 您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10%和12%的胶。60-80V, 1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时，换用100V , 3-4小时。3、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的 大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本 身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区别并不大。4、根据MARKER的条带 （我的是7条带：14、18、

51、25、35、45、66、116KD） ,您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带。这样第一，可以节省抗体， 第二，您要的目的条带肯定在上面。5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当 加大1抗浓度。6、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该 先找其他方面的原因。EEE.电泳用的是恒流， 一块胶，20mA ,100分钟左右。 转膜也是恒 流，38mA ,100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应 体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出 在抗原和一抗上，不知对不对。解答

52、：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至 胶的中部即可。正常条件下，电泳时漠酚蓝和10kd左右蛋白跑在一FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80100伏（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的 吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感 觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v左右，而用恒压，开始电流有110mA,但15min后，电流就降到8OmA , 30min后就稳

53、定在40mA ,不就相当于恒流吗？解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增 大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的 感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用 的是小胶40cm2 ,不知有无不同。GGG.我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多 越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法？解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或 过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进行转膜，下半时间短，上半时间长一

54、点，应该会好一些。HHH.请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这 样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼 龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。III. 1、煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存 多久？2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手 册？3、湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸？4、恒压转移 的条件如何确定，因为我要分离小至21KD

55、，中至66KD，大致170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围 了？解答：1、煮好后的样品，放到-20,我们在一个月后此样品，效果一 样。2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有。3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可 让ptglab帮你定夺。5、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否 则分离效果可能不是你所期望的。JJJ.怎

56、样设计实验来确定最佳的条件？ 解答：随便说一点，具体的还是需要白己想：1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1个大well,不插梳子，多上样，）SDS-page ;2、转移， 设定电流或电压；3、每隔1 （orn）小时，取一点膜染色，看转移效果。KKK.我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的 蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分钟，似乎没什么效果？解答：你可以加筑基乙醇（loadingbuffer一样的浓度），56度，30mins ,看看。LLL. 1、在用PBS洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose

57、复合物时，每次 要重悬多长时间合适？2、最后用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心 后，由于2XSDS中已经加入了漠芬兰，因此下面的Agarose珠子几 乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢？解答：1、不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了。2、力口2X BUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置 时小心点就是了。我也试过一些次，首先离心稍微长一点，长20秒 吧，希望胶粒能沉得结实点（我想象的），再吸取。如果感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是碰到胶粒了。彳艮难一点胶粒也吸取不上来 的，

58、尽力做好就是了。MMM.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？解答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也 可以，大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了。NNN. Western Blot中block的最短时间？解答：每一步1小时足够了，中间换抗体要洗的话多换液几次，每 次时间10分钟就够，洗3次只要半小时。跑胶1小时，转移1小 时，block半小时就行，1抗1小时，洗半小时，2抗1小时，洗半 小时，显色10分钟。一般跑两块胶，一块染色，一块westerno一天肯定完事，一般不用等到第二天。OOO.想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目

59、的蛋 白（定性），分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓 缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？解答：按照你提供的浓度，如果做Western Blot ,是不用浓缩样品的 对于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：1、转移时的时间，2、转移时的电流或电压.3、transfer buffer中加20%的甲醇.4、可以用13-15%的分离胶.PPP.蛋白分子量大小分别为21kd、28kd ,用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干

60、 转的话，用2.5 A/cm2 , 30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA,也得要半个多小时吧。QQQ.需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量， 但相互间干扰太 大， 怎么办？解答：将膜放入stripping buffer (SDS 2% ,Tris Cl (PH=6.7) 62.5mM , beta-筑基乙醇100mM )中，50C孵育30分钟，TTBS西三次， 再重新加入一抗，进行另一种抗原的检测。RRR.做Western Blot实验时，发现转膜时的电流总是偏小， 转膜的 效率也偏低.100V恒压转膜时的电流只有190mA左右，而以前都有250mA。体系和条件都和以前一