分子生物学导论-分子生物学研究方法(3)

1、1第九章第九章 分子生物学研究方法分子生物学研究方法(3)2第七节第七节 核酸序列分析技术核酸序列分析技术一、Sanger双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法三、DNA序列测定的自动化四、DNA杂交测序法 五、基因芯片测序六、最新测序技术4原理：原理：双脱氧（双脱氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的掺入新合成的DNA链中，但因链中，但因3端不具端不具OH基，基，DNA链合成至链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的故可

2、根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来一、一、Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 l 过程：过程：制备制备ss-DNA与引物与引物退火退火分为分为4个反应系统个反应系统每个每个系统中加入系统中加入dNTP（其中（其中dATP常带同位素标记）和常带同位素标记）和一种双脱一种双脱氧核苷酸氧核苷酸DNA聚合酶定序反聚合酶定序反应应反应产物变性后电泳反应产物变性后电泳凝凝胶干燥胶干燥放射自显影。放射自显影。 l 该法亦适合该法亦适合mRNA的序列分析。的序列分析。l GC富集区富集区常出现常出现“隐影隐影”或或“停止停止”现象，如

3、在反应中加现象，如在反应中加入入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解脱氧鸟苷可解决决GC富集区的测序。富集区的测序。ATGCGGTACCAT53测序模板555555555 555四套反应体系四套反应体系1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP TATACGCCATACGCCATGGTATACTACGCTACGCCTACGTACGCCATGTACGCCATGGTTACGCCATTACGCCATGGT2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

4、 + ddGTP4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP7双脱氧法的特点双脱氧法的特点 需要需要、和高质量的和高质量的。缺点缺点： （1）聚合反应会因二级结构而提前终止，常常测不到准确）聚合反应会因二级结构而提前终止，常常测不到准确的的DNA序列；序列； （2）由于经模板与引物结合后才能反应并测序，因此对于）由于经模板与引物结合后才能反应并测序，因此对于寡聚核苷酸寡聚核苷酸DNA序列（例如对引物序列（例如对引物DNA的序列）不能测定；的序列）不能测定； （3）该法直接分析的是合成的新链序列，而不是模板链，）该法直接分析的是合成的新链序列，而不是模板链，因此不能分析模板

5、中甲基化部位；因此不能分析模板中甲基化部位； （4）需要适当的引物和能合成单链模板的载体。）需要适当的引物和能合成单链模板的载体。优点优点：简单、快速。：简单、快速。8二、二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法基本步骤基本步骤:(1)先将先将DNA的末端之一进行标的末端之一进行标记记(通常为放射性同位素通常为放射性同位素32P)；(2)在多组互相独立的化学反应在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修中分别进行特定碱基的化学修饰；饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开在修饰碱基位置化学法断开DNA链；链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；

6、链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，根据放射自显影显示区带，直接读出直接读出DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。9化学测序法的优点：化学测序法的优点：（1）待测的）待测的DNA序列来自原有的序列来自原有的DNA分子，因此可以分析分子，因此可以分析DNA被修饰的碱基；被修饰的碱基；（2）测序反应不受）测序反应不受DNA二级结构的影响；二级结构的影响；（3）不需要将待测序的）不需要将待测序的DNA亚克隆到其他载体上，不需要通过亚克隆到其他载体上，不需要通过通用的引物；通用的引物；（4）可测定较短的）可测定较短的DNA序列。序列。化学测序法的缺点：化学测序法的缺点：（1）待测）待测DNA需要进

7、行末端放射性标记、变性聚丙酰烯胺凝胶电需要进行末端放射性标记、变性聚丙酰烯胺凝胶电泳分离分析，操作较复杂；泳分离分析，操作较复杂；（2）该方法测序范围约为）该方法测序范围约为250bp，稍低于双脱氧法；，稍低于双脱氧法；（3）本方法主要限制因素是变性聚丙酰烯胺凝胶电泳分离分析分）本方法主要限制因素是变性聚丙酰烯胺凝胶电泳分离分析分辨能力比较低。辨能力比较低。 10三、三、DNA序列测定的自动化序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化测序步骤与自动化 1）模板制备：可自动化）模板制备：可自动化 2）定序反应：可自动化）定序反应：可自动化 3）凝胶电泳：自动化有一定困难，制胶、点样、电泳、）

8、凝胶电泳：自动化有一定困难，制胶、点样、电泳、凝胶干燥、放射自显影。凝胶干燥、放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与计算机输入：可自动化）核苷酸序列阅读与计算机输入：可自动化 DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指一是指“分析反应分析反应”的自动化，另一方面则是的自动化，另一方面则是指指“读片过程读片过程”的自动化。的自动化。2. 自动测序仪自动测序仪 Conney等人于等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色红色引物引物+T反应系统（引物反

9、应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黑色引物黑色引物+G反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色绿色引物引物+A反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色兰色引物引物+C反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）12优点优点: (1) 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； (2) 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；自显影； (3) 可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。可连续电泳，可读出较多

10、的核苷酸序列。缺点：缺点：无法保留原始记录无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上四个反应产物点在一条道上,相互间会相互间会发生干扰发生干扰, 导致读序时分辨率下降。导致读序时分辨率下降。15四、四、DNA杂交测序法杂交测序法 自从自从70年代末期年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测杂交测序法序法（sequencing by hybridization，SBH）一种。它利用一）一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长组已知序列的寡核苷酸短序

11、列作探针，同某一特定的较长的靶的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。 DNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤：杂交测序实质上包括两个主要的步骤： 首先首先是将待测定的靶是将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，序的寡核苷酸探针进行杂交， 然后然后与那些能够同靶与那些能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸的核苷酸序列。序列。如果将一种核苷酸顺序为如果将一种核苷酸顺序为5-AGCCTAG

12、CTGAA-3的的12-mer的的靶靶DNA，与一组完全随机的，与一组完全随机的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总寡核苷酸探针混合杂交，在总数为数为48=65536种的种的8-mer探针群体中，仅有探针群体中，仅有5种会与靶种会与靶DNA形成形成完全互补的双链体分子。根据这完全互补的双链体分子。根据这5种发生了完全杂交作用的种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶的靶DNA分子的核苷酸顺序。分子的核苷酸顺序。当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得当然，这只是一种理想

13、化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。仍然会与之形成不稳定的双链分子。上图是两条长度均为上图是两条长度均为17-mer的靶的靶DNA片段片段I和和II的杂交测序结果，两者仅在的杂交测序结果，两者仅在第第8位碱基有不同，分别为位碱基有不同，分别为C和和T。靶靶DNA片段片段I可与可与18共共8段彼此相互重叠段彼此相互重叠的的8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第9段段8-mer寡核苷酸形成寡核苷酸形成完全的双链分子。

14、根据相邻的两段完全的双链分子。根据相邻的两段8-mer寡核苷酸之间各自具有寡核苷酸之间各自具有7个碱基的重个碱基的重叠情况，可以构建出互补的叠情况，可以构建出互补的DNA序列。序列。靶靶DNA片段片段II的杂交结果表明，横跨的杂交结果表明，横跨其第其第8位碱基位碱基T的的6段段8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第此其杂交效率明显下降；但与第1和第和第8两段两段8-mer寡聚体形成的具有末端寡聚体形成的具有末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段段8

15、-mer寡核苷酸能杂交寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段形成完全的双链体分子，证实与片段I相比，它在第相比，它在第8位发生了由位发生了由C碱基到碱基到T碱碱基的变化。基的变化。181 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTTAGATCDNA 样 品TATGCAATCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机 分析杂交图象并由探 针的重叠情况推导样品的核酸序列1 ATACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 GTTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA

16、2 CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG五、基因芯片测序五、基因芯片测序 基因芯片测序流程基因芯片测序流程20六、最新测序技术六、最新测序技术1. 新一代测序技术（新一代测序技术（Next generation sequencing technology） 美国美国Roche Applied Science公司的公司的454基因组测序仪基因组测序仪 美国美国Illumina公司公司 英国英国Solexa technology公司合作开发的公司合作开发的Illumina测序仪测序仪 美国美国Applied Biosystems公司的公司的SOL

17、iD测序仪测序仪 Dover/Harvard公司的公司的Polonator测序仪测序仪 美国美国Helicos公司的公司的HeliScope单分子测序仪单分子测序仪 所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略循循环芯片测序法环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将其称为），也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术新一代测序技术或者第二代测序技术”。 21焦磷酸测序焦磷酸测序边合成边测序边合成边测序边连接边测序边连接边测序3730 xlSanger双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸新一代测序技术的发展为基因组学研究带来了更大的机

18、遇新一代测序技术的发展为基因组学研究带来了更大的机遇http:/ 第三代测序技术（第三代测序技术（Third generation sequencing technology）英国牛津纳米孔公司英国牛津纳米孔公司 基于纳米孔的基于纳米孔的单分子读取单分子读取技术。技术。该技术在测序时该技术在测序时DNA分子依靠核酸外切酶一次一个碱基地分子依靠核酸外切酶一次一个碱基地通过小孔，无需多次扩增和荧光标记。通过小孔，无需多次扩增和荧光标记。 26第八节第八节 转基因技术转基因技术一、植物基因转化载体系统的构建二、受体材料的选择三、植物遗传转化体系四、转化体的筛选和鉴定适宜外植体的选择及再生体系的建立适

19、宜外植体的选择及再生体系的建立抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择遗传转化操作遗传转化操作l 载体介导的载体介导的 转化方法转化方法l DNA直接导入法直接导入法l 种质系统法种质系统法选择培养选择培养转基因植株鉴定转基因植株鉴定获得再生植株获得再生植株转化质粒的构建转化质粒的构建转基因植株的繁殖与应用转基因植株的繁殖与应用利用报告基因利用报告基因Southern 杂交杂交Northern 杂交杂交Western 杂交杂交植物遗传转化流程植物遗传转化流程301. 一元载体系统一元载体系统一元载体系统是中间表达一元载体系统是中间表达载体与改造后的受体载体与改造

20、后的受体Ti质质粒通过同源重组所产生的粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又一种复合型载体，通常又称为称为共整合载体共整合载体。 一、植物基因转化载体系统的构建一、植物基因转化载体系统的构建312. 双元载体系统双元载体系统双元载体系统是指两个分别含有双元载体系统是指两个分别含有T-DNA和和Vir区的相容性区的相容性突变突变Ti质粒构成的双质粒系统，由于其质粒构成的双质粒系统，由于其T-DNA和和Vir区在区在两个独立的质粒上，通过反式激活两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称转移，故又称为为反式载体反式载体。 一元载体一元载体(顺式载体顺式载体)双元载体双元载体(反式载

21、体反式载体)32二、受体材料的选择二、受体材料的选择受体受体是指用于接受外源是指用于接受外源DNA的转化材料。的转化材料。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1. 高效稳定的再生能力；高效稳定的再生能力； 2. 受体材料要有较高的遗传稳定性；受体材料要有较高的遗传稳定性； 3. 外植体来源方便，如胚和其它器官等；外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4. 对筛选剂敏感；对筛选剂敏感； 5. 转化率高。转化率高。33常用的受体材料有以下几大类型常用的受体材料有以下几大类型:1. 愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统 外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤

22、组织，转化外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化(带带有目的基因质粒的农杆菌侵染有目的基因质粒的农杆菌侵染)，分化培养获得再生植株。，分化培养获得再生植株。优点优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。转化效率高。缺点缺点：遗传稳定性差、嵌合体：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统因此需要连续的再生系统342. 直接分化再生系统直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。接分化出不定芽形成再生植株。优点优点：周期短、操作简

23、单，体细胞变异小，遗传稳定；：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点缺点：材料局限，转化率低。：材料局限，转化率低。353. 原生质体再生系统原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。生受体系统之一。优点优点：高效、广泛地摄取外源：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；化系统；缺点缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。：不易制备、再生困难和变异程度高。3

24、64. 胚状体再生系统胚状体再生系统 是指具有胚胎性质的个体。是指具有胚胎性质的个体。优点优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强，：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。嵌合体少，易于培养、再生。缺点缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。375. 生殖细胞受体系统生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受

25、体系统；转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。38三、植物遗传转化体系三、植物遗传转化体系（一）载体型遗传转化系统（一）载体型遗传转化系统u 最常见的转基因方法。最常见的转基因方法。u 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。随核染色体复制和表达。u 农杆菌农杆菌Ti

26、质粒质粒（tumor-inducing plasmid）或）或 Ri质粒质粒(root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。39农杆菌共培养侵染诱导愈伤组织分化生芽生根叶盘转化法(1)(1)叶盘法叶盘法 双子叶植物双子叶植物较为常用、简单有效的方法。较为常用、简单有效的方法。40 (2) 真空渗入法真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使

27、农的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。该法简便、快速、可靠，不需要组织培养。化。该法简便、快速、可靠，不需要组织培养。(3) 愈伤组织共培养愈伤组织共培养(4) 原生质体共培养原生质体共培养41（二）（二）DNA直接转化系统直接转化系统 1. 化学刺激法化学刺激法 细胞融合剂：聚乙二醇（细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（）、聚乙烯醇（PVC）转化顺利，对细胞伤害小；转化顺利，对细胞伤害小；避免嵌合体的生成；避免嵌合体的生成；易于选择；易于选择；便于进行理论研究；便于进行

28、理论研究；受体广泛。受体广泛。 优点：优点：42将外源将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。并得以表达。步骤简单易行：适合于大多数细胞或步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。方法之一。2. 基因枪轰击法基因枪轰击法 （微弹轰击技术（微弹轰击技术m

29、icro-projectile bombardment) 433. 高压电穿孔法高压电穿孔法电击法电击法 利用高压脉冲作用，在原利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源通道，从而促进外源DNA的摄取。的摄取。444. 微注射法微注射法 细胞操作：细胞操作： 利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或或RNA直接注射进入受体细胞。直接注射进入受体细胞。子房注射法或花粉管通道法：子房注射法或花粉管通道法

30、： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。作简便、成本低。45四、转化体的筛选和鉴定四、转化体的筛选和鉴定1. 转化体的筛选转化体的筛选 外源目的基因转化频率低外源目的基因转化频率低 目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少 使用特异性选择标记基因（使用特异性选择标记基因（selectable marker genes）进行标记，有效地选择出真正转化细胞。进行标记，有效地选择出真正转化细胞。常用选择标记基因：常用选择标记基因： 抗生素抗性基因；抗生素抗性基因； 除草剂抗性基

31、因除草剂抗性基因 将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细粒载体上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。462. 转化体的鉴定转化体的鉴定（1）DNA水平的鉴定水平的鉴定（2）转录水平的鉴定）转录水平的鉴定（3）翻译水平的鉴定）翻译水平的鉴定 47第九节第九节RNAi技术技术 RNA干扰（干扰（RNA inter

32、ference, RNAi）是指在进化过程中）是指在进化过程中高度保守的、由双链高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。高效特异性降解的现象。 一、一、RNAi的发现的发现1995年，康乃尔大学的年，康乃尔大学的Guo等等秀丽新小杆线虫秀丽新小杆线虫(C.elegans) 二、二、RNA干扰的作用机制干扰的作用机制49 基因敲除基因敲除又叫基因打靶，通过外源又叫基因打靶，通过外源DNA与染色体与染色体DNA之间的之间的同源重组同源重组，进行精确的定点修饰和基因改，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一

33、性强、染色体造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳可与目的片段共同稳定遗传等特点。定遗传等特点。l 完全基因敲除完全基因敲除l 条件型基因敲除条件型基因敲除第十节第十节 基因敲除技术基因敲除技术 (gene knock-out)51第十节第十节 蛋白组学及其研究技术蛋白组学及其研究技术 一、蛋白质组学的研究内容二、蛋白质组学的研究技术 1. 免疫组织化学技术 2. 双向电泳技术 3. 生物质谱技术 4. 酵母双杂交和噬菌体展示技术 5. 芯片技术 6. 凝胶阻滞电泳（EMSA） 7. DNase I 足迹法52mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生

34、理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为称为蛋白质组蛋白质组(proteome) 蛋白质组学蛋白质组学(proteomics) 是是1994年澳大利亚年澳大利亚学者学者Wilkins 和和Williams提出的。提出的。蛋白组学蛋白组学(proteomics)旨在阐明生物体全部旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式、结构、功能鉴定蛋白质的表达、存在方式、结构、功能和相互作用等。和相互作用等。 53一、蛋白质组学的研究内容一、蛋白质组学的研究内容1. 蛋白质鉴定蛋白质鉴定2.

35、翻译后修饰翻译后修饰3. 蛋白质功能确定蛋白质功能确定4. 医学应用医学应用54二、蛋白质组学的研究技术二、蛋白质组学的研究技术蛋白质组学分为蛋白质组学分为结构蛋结构蛋白质组学白质组学和和功能蛋白质功能蛋白质组学组学两大类。两大类。前者主要研究蛋白质氨前者主要研究蛋白质氨基酸序列及三维结构、基酸序列及三维结构、种类分析和数量确定；种类分析和数量确定；后者主要研究蛋白质的后者主要研究蛋白质的功能和相互作用。功能和相互作用。（一）免疫组织化学技术（一）免疫组织化学技术（二）双向电泳技术（二）双向电泳技术57（三）生物质谱技术（三）生物质谱技术58（四）酵母双杂交和噬菌体展示技术（四）酵母双杂交和噬菌体展示技术（五）芯片技术（五）芯片技术61（六）凝胶阻滞电泳（六）凝胶阻