植物生理学试验指导

1、1实验1植物组织渗透势的测定（质壁分离法）原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的深液浓度。代入公式即可计算出春渗透势。仪器药品显微镜载玻片及盖玻片镶子刀片配成0.5 0.1mol/L梯度浓度的蔗糖溶液各50ml。称34.23g蔗糖用蒸储水配成100ml，其浓度为1m0le/L（母液）。再配制成下列各种浓 度：操作步骤将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素

2、的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔薛、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，5 10分钟后，从0.5mol/L开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察，如0.50mol/L :吸母液0.45mol/L :吸母液0.40mol/L :吸母液0.35mol/L :吸母液0.30mol/L :吸母液0.25mol/L :吸母液0.20mol/L :吸母液0.15mol/L :吸母液0.10mol/L :吸母液25ml+水25ml22.5ml+水27.5ml20.0ml+水3

3、0.0ml17.5ml+水32.5ml15.0ml+水35.0ml12.5ml+水37.5ml10.0ml+水40.0ml7.5ml+水42.5ml5.0ml+水45.0ml2果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓 度，和不引起质壁分离的最高浓度。在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。将结果记录下表中。测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平

4、均值 之后，可按下列公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。一=RTiC-R为细胞渗透势。R为气体常数=0.083 X 105/L - Pa /mol - K。T为绝对温度，单位K,即273C +t, t为实验湿度。I为解离系数，蔗糖为1。C为等渗溶液的浓度，单位为mol/L。贝上_ 0.5%NaNO及蒸储水各15ml。3.撕蚕豆叶表皮若干放入上述3个培养皿中。4.培养皿放入25 C温箱中，使溶液温度达到25 C。5.将培养皿置于人工光照条件下照光半小时。6.分别在显微镜下观察气孔的开度。ii实验8植物的元素缺乏症（溶液培养）原理植物的生长发育，除需要充足的阳光和水分外，还需要矿质元素，否则植

5、物就不能很好地生长发育甚至死亡。应用溶液培养技术，可以观察矿质元素对植物生活的必需性；用溶液培养做植物的营养试验， 可以避免土壤里的各种复杂因素。近年来也已应用溶液培养进行无污染蔬菜的栽培生产。仪器药品分析天平培养缸（瓷质或塑料）鱼缸打气泵量筒烧杯移液管按下表分别配制贮备液，所用药品均需为分析纯：药品名称用量（g/L）Ca(NO) 282.07KNO50.56MgSO 7H2O61.62KHPO27.22NaNO42.45MgC223.81NaSO35.51CaCl255.50KCl37.28Fe-EDTANa-EDTA 7.45g,FeSO4- 7HO 5.57g微量元素H3BO 2.860

6、g,MnSO41.015g,CuSO 5HO 0.079g,ZnSO4.7H2O0.220G,H2MO40.090g12操作步骤1.材料准备番茄、跷麻、小麦、玉米等都作为材料。粒小的种子，从种了带来的营养元素少，缺乏 症容易出现，粒大的种子可以在幼苗未做缺元素培养之前，先将胚乳(或子叶)除去，这样 也可以加速缺乏症的出现。种子用漂白粉溶液灭菌30分钟，用无菌水冲洗数次，然后放在洗净的石英砂中发芽，加蒸储水，等幼苗长出第一真叶时待用。2.配制缺元素培养液按下表用量配制缺元素培养液:贮备液贮备液(ml)完全-N-P-K-Ca-Mg-S-Fe缺微量Ca(NO)210101010101010KNO10

7、101010101010MgSO10101010101010KHPO10101010101010Fe-EDTA11111111微量兀素1111111NaNO1010MgCl210Na2SO310CaCl210KCl102.5配制时先取蒸储水900ml,然后加入贮备液，最后配成1 000ml ,以避免产生沉淀。培养液配好后，用稀酸、碱调节至pH5H 63.培养观察先取大小一致的植株，用泡沫塑料包裹茎部，插入培养缸盖的孔中，每孔一株。将培养 缸移到温室中，经常注意管理并观察，用蒸储水补充缸中失去的水分。每隔一定时间(一周左右，随植株大小而定)更换培养溶液，并测定换出溶液的pH=植株长大后要通气，通

8、气可用鱼缸打气泵。注意记录植株的生长情况，各种元素缺乏症的症状及出现的部位。4.元素缺乏症检索1.老叶受影响。(1)影响遍及全株，下部叶子干枯并死亡。13a.植株淡绿色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱,缺Nb.植株深绿色，并出现红或紫色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱，,，缺P(2)影响限于局部，有缺绿斑，下部叶子不干枯，叶子边缘卷曲呈凹凸不下。a.叶子缺绿斑有时变红，有坏死斑，叶柄纤弱，,，缺Mgb.叶子缺绿斑，在叶边缘和近叶消耗或叶脉间出现小坏死斑，叶柄纤弱,缺Kc.叶子缺绿斑，叶子包括叶脉产生大的坏死斑，叶子变厚，叶柄变短,缺Zn2.幼叶幼叶受影响。(1)顶芽死亡，叶子变形和坏死。a.幼叶变钩状

9、，从叶尖和边缘开始死亡,缺Cab.叶基部淡绿，从基部开始死亡，叶子扭曲,缺B(2)顶芽仍活着，缺绿或萎而无坏死斑。a.幼叶萎焉，不缺绿，茎尖弱,缺Cub.幼叶不发生萎缺绿。(a)有小坏死斑， 叶脉仍绿色， ,，缺Mn(b)无坏死斑，叶脉仍绿色,缺Fe(c)无坏死斑，叶脉坏死,缺S5.待植株症状表现明显后，将缺元素培养液换成完全培养液，留下一株继续培养，观察植株症状是否减轻以至消失。其余植株测量根、茎的长度，重量，叶子数目、大小和重量,节数和节间长度，然后在烘箱中烘干，作为实验15、16、17、18的材料，测定植株中的氮，磷，铁，铜的含量。14实验9硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酸是植物氮素代

10、谢作用中关键性酶，与作物吸收各利用氮肥有关。它作用于NO-3使还原为NO%；NO-3+NADH+H+r NO-2+NAD+H2O产生的NO-2可以从级织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2含量的增加，即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。NO-2含量的测定用磺胺对氨基苯磺酸胺（sulfanil-amide ）比色法。在酸性溶液中磺胺与NO-2形成重氮盐，再与a-荼胺偶联形成紫红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮 化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降 低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种

11、方法非常灵敏，能测定每ml含0.5 g的NaNO2。仪器药品0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5 （见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22gKNO3于1 000ml蒸储水中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸储水稀释至100ml。a-荼胺试剂：0.2ga-荼胺溶于含1ml浓盐酸的蒸储水中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸储水溶角成1 000ml。然后吸取5ml，再加蒸储水稀释成1 000ml，此溶液每ml含有NaNO210 g,用时稀释之。操作步骤1.将新鲜取回的叶片（跷麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水先，用吸721型分光光度讨保温

12、箱真空干燥器三角烧瓶烧杯真空泵（或注射器）天平钻孔器移液管151cm的圆片，用蒸储水洗涤23次，吸干水分，然后 于台夭平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3-0.4g（或每份取50个圆片） ， 分别置于 含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液 （pH7.5）5ml+蒸储水5ml;（2） 0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5） 5ml+0.2mol/L KNO35ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射

13、器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30C温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml,以测定NO；含量。注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低， 此时则可于反应溶液中加入30 g 3-磷酸甘油醛或1,6-二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。2. NO-2含量的测定保温30分钟的结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及a-荼胺试 剂2ml,混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测定，比色波长为520nm，记下吸光度或透光率，从标准曲线上

14、查得NO-2含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO-2g或mol表示之。3.绘制标准曲线测定NO-2 K磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1邱/ml的NaNO2含量，可于05 g/ml浓度范围内绘制标准曲线。由于显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5 g/ml） 1ml于试管中，加入 磺胺试剂2ml及a-荼胺试剂2ml，混合摇匀，静置303分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟），立即于分光光度计中进

15、行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度-浓度曲线。水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约16实验10叶绿体色素的提取和分离（纸层析法）原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。分离色素的方法有多种， 纸层析是其中最简便的一种。 当溶剂不断地从层析滤纸上流过 时，由于混合物中各成分在两相 （即流动相和固定相） 间具有不同的分配系数， 它们的移动 速度

16、不同，使样品中的混合物得到分离。仪器药品大试管台天平研钵烧怀漏斗软木层新华滤纸丙酮四氯化碳无水硫酸钠碳酸钙石英砂操作步骤1.称取新鲜叶子2 g,放入研钵中加丙酮5ml,少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆， 再加丙酮5 ml,然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。2.取准备好的滤纸条（2X 2 cm）,将其一端剪去两侧， 中间留一长约1.5cm,宽约0.5cm的窄条，如图7。3.用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多。如色素过淡，用电吹风吹干后再点1一2次。4.在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于

17、液面，滤纸条边缘不可碰图到试管壁）， 盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。175.经过0.5 1小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a,最后的黄绿色为叶绿素bo实验11植物体色素及其性质原理植物色素包括脂溶性的叶绿体色素和水溶性的细胞波色素，前者存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿素；后者存在于液泡中，特别与花朵的颜色有关，如花青素属黄酮类物质。了解它们的性质有助于对其生理功能的理解。仪器药品分光计天平研钵分液漏斗移液管吸球试管碳酸钙氢氧化钾丙酮乙酰甲酸盐酸醋酸铜操作步骤1.叶绿体色素的提取取菠菜（或其他植物）叶子2g,放在研钵中，加石英

18、砂和碳酸钙少许，丙酮约5 ml,研磨成匀浆，再加丙酮15 ml,则得深绿色提取液，用漏斗过滤之，即为色素提取液。2,叶绿素的荧光现象取上述色素丙酮提取液少许于试管中，用反射光和透射光，观察提取液的颜色有无不同，反射光观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光颜色.3.光对叶绿素的破坏作用取上述色素丙酮提取液少许，分装在2支试管中，1支试管放在黑暗处（或用黑纸包裹）另1支试管放在强光下 （太阳光）经2 3小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？4,铜在叶绿素分子中的替代作用18取上述色素丙酮提取液少许于试管中，1滴1滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋

19、酸铜晶体1小块，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。5.黄色素和绿色素的分离取上述色素丙酮提取液10 ml,加到盛有20 ml乙酰的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入20ml蒸储水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙酰中，弃去下层丙酮和水，再用蒸储水冲洗乙酰溶液1 2次。然后于色素乙酰溶液中加入5ml30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗， 静置10分钟，再加蒸储水约10 ml,摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层，分别保存于试管中。6.观察色素溶液的吸收光谱(1)调节分光计，观察电灯光的光谱。(2)观察色素

20、丙酮提取液，用丙酮将溶液稀释1倍比较之。(3)观察黄色素乙酰溶液，用乙酰将溶液稀释1倍比较之。(4)观察皂化叶绿素甲醇溶液，用甲醇将溶液稀释1倍比较之。(5)观察被光破坏的色素丙酮溶液，试与(2)作比较。(6)观察被铜取代了镁的色素溶液。19实验12叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）原理如果混合液中的两个组分， 它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代教方法，计 算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。如图9叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nr

21、n,叶绿素b在645nrn ,吸收曲线彼此又在重叠。根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系（参阅实验86）:Al=Ca kal+ Cb kb1A2=Ca - ka2+Cb, kb2式中：Ca为组分a的浓度，g/ L。Cb为组分b的波度，g/L。Al为在波长入1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。A2为在波长入2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。kal为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长入1时的吸光度A值。Kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长入2

22、时的吸光度A值。ka2为组分a（浓度为1 g/L）在波长入2时的吸光度A值。Kb1为组分b（浓度为1 g/L）在波长入1时的吸光度A值。从文献中可以查得叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下:波长（nm）叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式（1）、（2）,则得:A663=82.04 X Ca+9.27 X CbA645=16.75 X Ca+45.60 X Cb20经过整理之后，即得到下式:Ca=0.012 7A663-2.69A645Cb=22.9A645 4.68A663(4)CT=Ca+Cb=8.02A663+

23、20.21A645(5)(5)式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。利用上面(3)、(4)、(5)式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。注：一般大学教学实验室所用的人光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm (663一645nm),难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定 的正确性就更差了。根据公式计算往往会得到叶绿素a : b值小于1,这就不很奇怪了。除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波

24、长650 670nm和630- 650nm之间，每隔1 2nm测定叶绿素a或b的吸光度A,以确定叶绿素a和b的吸收峰的波长。如果测得的 峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便 的方法可以打开仪器盖子，松动波长刻度盘紧固螺丝，调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器。为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g,用乙酰提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油酰。层析结束，用剪刀

25、小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿素的叶绿素b,注意剪时尽量避开有可能遭污染的地区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和bo21实验13叶绿体的分离原理分离叶绿体应在等渗溶液中制备，以减少渗透压对叶绿体的伤害，仔细研磨，然后离心取得叶绿体的悬浮液。整个过程应在05 C下进行，所有提取物、溶液和材料，也应保存在该温度下，分离后活性测定工作应尽快进行。仪器药品离心机天平容量瓶量筒移液管研钵烧杯纱布0.35mol/L NaCl35m mol/L NaCl10m mol/L Tris-HCl缓冲剂，Ph7.8（见附表2）操作步骤1.最好在晴天上午10时左右，选取健康的菠菜叶（也可用豌豆叶），洗净，擦

26、干，去叶柄及主脉，称取10g鲜重在冰浴中研磨。2.研磨时加入20ml 0.35mll/L NaCl , 2ml 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，以及少量石英砂。3.研磨成匀浆后，用4层纱布过滤于烧杯中。4.滤液用1 000r/min离心2分钟，弃去沉淀，收集上清液。5.上清液用3 000r/min离心5分钟，弃去上清液，沉淀即是叶绿体。6.将沉淀分成2份，分别加入0.35mol/L NaCl溶液和35mmol/L NaCl溶液各10 ml,制成悬液，使叶绿体分别处于等渗和低渗溶液中，以获得完整叶绿体和破碎叶绿体。 保存在冰箱中，用于实验41的测定。22实验14离体叶绿体对染料的还原

27、作用（希尔反应）原理离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂存在下，例如染料二氯靛酚（DCPIP）,当照光时， 可以使水光解释放氧气， 同时使染料还原， 结果染料从原来的蓝色变为粉红色至无色。 此反 应为希尔所发现，故常称为希尔反应。可用分光光度计测定反应前后染料吸光度A的变化，变化在4 5分钟内呈线性关系。仪器药品721型人光光度计试管架烧杯容量瓶移液管试管100m mol/L磷酸缓冲液，pH7.3（见附表2）0.3m mol/L 2, 6二氯靛酚钠；称取8.7mg二氯靛酚钠，加蒸储水定容至100ml（如药品纯度低，可适当提高浓度）。操作步骤1.加样取干净试管6支，分为两组，并分别编成1、2、3号，

28、然后按下表加入试剂。吕亏磷酸缓冲液（ml）叶绿体悬液（ml）煮沸（分钟）二氯靛酚（ml）完整叶19.40.20.5绿体29.40.250.539.90.2叶绿体19.40.10.5碎片29.40.150.539.90.1注：（1）叶绿体悬液为实验40所制备。（2） 2号管加叶绿体悬液后于沸水浴上煮5分钟，然后用蒸储水补足丧失的水分。（3）3号管为比色时调节零点用。（4）各试管都在最后加入二氯靛酚以开始反应，并立即摇匀进行比色测定，以代表作 用时间为0。各管在加染料之前保存在冰浴中。232.比色当加入染料后立即摇匀倒入相应的比色杯中，迅速测定吸光度，波长为620nm,此即代表0时的吸光度。然后将

29、比色杯置于离150W灯光约60cm处照光，每隔1分钟快速读下吸光度的变化，连续进行5、6次读数,严格控制照光时间。3.将结果以每分钟A620的变化量( A620/min)为纵坐标，以时间(分钟)为横坐标 作图。24实验15改良半叶法测定大田光合强度原理改良半叶法系将植物称叶片的一部分遮光或取下置于暗处，另一部分则留在光下进行光合作用，过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同等面积，分别烘干称重。因为对称叶片的两对应部位的等面积的干重，开始时被视为相等，照光后叶片重量超过暗中的叶重， 超过部分即为光合作用产物的产量，并通过一定的计算可得到光合作用强度。仪器药品分析天平烘箱剪刀称量皿刀片金属模板

30、纱布锡纸三氯乙酸操作步骤1.选择测定样品在田间选定有代表性植株叶片(如叶片在植株上的部位、叶龄、受光条件等)20张，用小纸牌编号。2.叶子基部处理为了不使选定叶片中光合作用产物往外运，而影响测定结果的准确性，可采用下列方法进行处理：(1)可将叶子输导系统的韧皮部破坏。如棉花等双子叶植物的叶片，可用刀片将时柄 的外皮环割约0.5 cm宽。(2)如小麦、水稻等单子叶植物，由于韧皮部和木质部难以分开处理，可用刚在开水中浸过的纱布或棉花做成的夹子。将叶子基部烫伤一小段即可(一般用90 C以上的开水烫2520秒)。26（3）由于棉花叶柄木质化程度低， 叶柄易被折断。用开水烫，又难以掌握烫伤的程度,往往不

31、是烫得不够便是烫得过重而叶片下垂，改变了叶片的角度。因此可改用化学方法来环割，选用适当浓度的三氯乙酸，点涂叶柄以阻止光合产物的输出。白质沉淀剂，渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死，而起到阻止有机养料运输的作用。酸的浓度，视叶柄的幼嫩程度而异。以能明显灼伤叶柄，而又不影响水分供应，不改变叶片 角度为宜。一般使用5%三氯乙酸。3.剪取样品叶基部处理完毕后， 即可剪取样品，记录时间，开始光合作用测定。 一般按编号次序分别剪下对秋叶片的一半（主脉不剪下），按编号顺序夹于湿润的纱布中，贮于暗处。过5小时后，再依次剪下另外半叶，同样按编号夹于湿润纱布中，两次剪叶的速度应尽量保持致，使各叶片经历相等的照光时数。

32、4.称重比较将各同号叶片之两半按对应部位叠在一起，在无粗叶脉处放上已知面积（如棉花可用1.5 x 2cm）的金属模板，用刀片沿边切下两个叶块，分别置于照光及暗中的两个称量皿中,计算公式如下:光合作用强度=切取叶面积总和（dm）尺照光时数（h）由于叶内贮存的光合产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘系数 碳同化量，单位为 CO2, mg/（dm2- h）o实验16淀粉的合成-淀粉磷酸化酶原理植物的组织中有一种淀粉磷酸化酶，能利用1-磷酸葡萄糖合成淀粉，生成的淀粉可用三氯乙酸是一种强烈的蛋三氯乙80 90 C下烘至恒重（约5小时），在分析夭平上称重比较。5.计算结果叶片干重差之总和（mg）除以叶

33、面积（换算成dm2,1dm2=100cm2）及照光时数，即得光合作用强度，以干物质,mg/ (dm2- b)表示之。干重增加总数（mg）1.5,得二氧化27I2-KI染色检出。1-磷酸葡萄糖一竺_.淀粉仪器药品台天平离心机水浴锅研钵移液管i%i-磷酸葡萄糖0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸缓冲液，pH6.5,（见附表2）。I2-KI溶液：溶液1.5gKI于少量蒸储水中，加入结晶碘0.3g，待溶解后，稀释100ml。操作步骤1.取马铃薯块茎一个，削去皮，切成小块，称取10g,于研钵中加石英砂少许，用10ml0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸缓冲溶液研磨成匀浆。2.用纱布滤取汁

34、液，于3 500 r/min离心15分钟，以除去淀粉，即为粗制酶液。3.取小试管2支，分别加入1%1-磷酸葡萄糖1ml，再于1管中加入1ml粗制酶液，另1管中加入已经煮沸15分钟的粗制酶液。 摇匀试管，立即各吸取1滴于白瓷板上，分别加1滴I2-KI溶液，测试有无淀粉存在。4.以后每隔10分钟，取试管中混合液1滴，检查淀粉的生成。比较煮沸能否使酶失活？28实验17植物呼吸强度的测定(小篮子法)原理利用Ba (OH)2溶液吸收呼吸过程中释放的CO2,实验结束后，用草酸溶液滴定残留的Ba (OH)2,从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程中释放的CO2量。仪器药品广口瓶温度计酸式滴定管

35、干燥管尼龙网制小篮0.05 mol/L Ba (OH )2指示剂：0.1%麝香草酚猷酒精溶液(见附录表4)。1/44 mol/L草酸溶液：准确称取重结晶的草酸H2C2O4 -2H2O2.8652g,溶于蒸储水，配成1 000ml，每ml溶液相当于1mg的CO2。操作步骤1.取500ml广口瓶一个，装配一只三孔橡皮塞，一孔插入盛碱石灰的干燥管，以吸收空气中的CO2,保证进入呼吸瓶的空气无CO2,一孔插入温度计，另一孔直径约1cm左右 供滴定用，滴定前用小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一尼龙网制小篮，用以盛实验材料， 整个装 置如图所示。2.称取萌发的小麦或水稻种子15g,装于小篮内， 将小篮挂在广口瓶内

36、， 同时加0.05mol/L Ba (OH)2溶液25ml于广口瓶内， 立即塞紧瓶塞， 并用熔化的石蜡密封瓶口，防止漏气。每10分钟左右，轻轻地摇动广口瓶，破坏溶液表面的BaCO3薄膜，以利对CO2的吸收。3. 1小时后，小心打开瓶塞，迅速取出小篮，加入2滴指示剂，立即重新塞紧瓶塞。然后拔出小橡皮塞， 将滴定管插入小孔中，用1/44 mol/L的草酸滴定，直到蓝绿色转变成无色为止。记录滴定所耗用的草酸溶液的ml数。4.另取用沸水煮死的种子为材料，作同样测定，以此作为对照。295.计算30呼吸强度 CO2, mg /( g h)=-种子鲜重式中V0为煮死的种子，所耗用草酸的ml数,Vi为发芽的种

37、子，所耗用草酸的ml数。(g) 时间(h)31实验18过氧化物酶活性的测定（比色法）原理过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下， 过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光度计测量生成物的含量。仪器 药品721型分光光度计离心机秒表夭平研钵磁力搅拌器愈创木酚30%过氧化氢20 mmol / L KH2LPO4100mmo1/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）反应混合液：100 mmo1 /L磷酸缓冲液（pH 6 . 0） 50 ml于烧杯中，加入愈创木酚28 1,于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%经过氧化氢19 1,混合均匀，保

38、存于冰箱中。操作步瞩1.称 取 植 物 材 料1g,加20 mmol / LKH2PO45 ml,于研钵中研磨成匀浆，以4 000r /min离心15分钟，倾出上清液保存在冷处，残渣再用5 ml KH2PO4溶液提取一次，合并 两次上清液贮于冷处备用。2.取光径Icm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3m1, KH2PO41m1 ,作为校零 对照，另1只中加入反应混合液3ml,上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启 秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长470nm下进行。3.以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min - mg蛋白质（或

39、鲜重g）表示之。蛋白质含量测定参阅实验56。32实验19多酚氧化酶活性的测定（氧电极法）原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶， 能使一元酚和二元酚氧化生成醍。 多酚氧化酶活性可 以用氧电极测量反应耗氧的速度，或用比色法测量产物的形成，常用的底物如儿茶酚（邻苯 二酚）和多巴（3,4-二羟苯丙氨酸）。仪器药品测氧仪记录仪超级恒温水浴离心机磁力搅拌器匀浆机反应杯微量注射器不溶性PVP（聚乙烯毗咯烷酮，polyvinylpyrrolidone）1mmol/L儿茶酚：o.11 g儿茶酚溶于1000ml0。1mol/L磷酸缓冲液中，pH 6.5。0.1mol/ L磷酸缓冲液，pH6. 5（见附表2）.操作步骤

40、1.粗酶的制备（1）称取马铃薯块茎20 g,加不溶，性PVP 2 g（事先用蒸储水浸洗，然后过滤以除去 杂质），磷酸缓冲液100ml,于匀浆机中打碎成匀浆，用尼龙网袋（或纱布袋）过滤，得滤 液。（2）滤液中加入30%饱和度硫酸铉（见附表8）,离心除去沉淀，上清液再加硫酸铉使 达60%饱和度，离心收集沉淀。（3）将所得沉淀溶于少量0.01 mol/L磷酸缓冲液中（pH6.5），即为粗制酶液，于同样缓冲液中透析过夜，其间更换透析溶液3 4次。2.酶活性测定（1）按实验88所述，将测氧仪、记录仪、恒温水浴（25C）的管路和电（线）路连接 好，然后进行仪器的标定。以求得记录纸上每小格相当的含氧量。（2

41、）测定酶活性时，先于反应杯中倒入底物儿茶酚，特记录仪上画出一条直线，用微量注射器经小孔注入合适浓度的酶液10 l,记录氧消耗曲线。（3）取氧消耗曲线的曲线部分，计算酶活性大小，酶活性以耗 。2 l/nmin酶液表示 之。33实验20植物体内有机物运输途径(环割法)原理韧皮部的筛管是植物体内有机物质运输的通道，环割试验即可以证明这一点。 在木本植物的枝条或树干上，用刀环形剥去一层树皮， 深达形成层，从而阻断了割环上下方有机物的 交换，在割环的上方聚集着从叶片运率的大量有机物，引起树皮组织生长加强， 而形成愈伤组织或瘤状物。仪器解剖刀操作步骤1.夏季，在幼龄杨树或其他木本植物上选定尚未发生分枝的旺

42、长枝条，于其中1 2枝进行环状剥皮，使剥环宽度在3cm左右。环割后，每星期观察一次枝条变化，并与生长情况相似的对照枝条进行比较，特别注意观察以下几个方面；(1)剥环上部叶片是否萎(2)枝条顶端生长速度有何改变？(3)剥环上下切口愈伤组织生长情况。(4)剥环上下部休眠芽萌发情况。2.另选一相似枝条进行双环割，再剥环相距40-50cm,同样观察以上各项。3.秋季要将以上处理的枝条剪下(连同对照枝条，风于保存作教学材料)。34实验21呵噪乙酸氧化酶活性的测定原理呵噪乙酸在呵噪乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内呵噪乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内呵噪乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物

43、的生长。酶活力的大小可以其破坏呵噪乙酸的速度表示之。呵噪乙酸的含量可用比色法测定。仪器药品721型分光光度计离心机恒温水浴锅天平研钵试管移液管烧杯20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）。1mmol/L2,4-二氯酚：称取二氯酚16.3mg用蒸储水配成100ml。1mmol/L氯化镒：称取MnCh - 4HO19.8mg用蒸储水配制成100ml。1 mmol/L呵噪乙酸：称取IAA17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约90ml蒸储水的容量瓶中（100ml）,稀释至刻度。呵噪乙酸试剂A或B（任备其中之一）：试剂A： 15ml0.5mol/LfeCl3,300ml浓硫酸（比重为1

44、.84 ）, 500ml蒸储水，使用前混合之即成，避光保存。用时1ml样品中加入试剂4ml。试剂B： 10ml0.5mmol/LfeCl3,500ml35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。用时于1ml样品中加入试剂2ml。试剂B较试剂A灵敏。操作步骤1.将大豆或绿豆种子于30C温箱中萌发3-4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。2.取20株胚轴，称得重量，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml,石英砂少许，置 冰浴中研磨成匀浆。 再按100mg鲜重材料加入1ml提取液的比例， 用磷酸缓冲液稀释之。 离 心 （4000r/min）20分钟，所得上清液即为粗酶液。353.取试管2支

45、，于一试管中加入氯化镒1ml,二氯酚1ml, IAA2ml，磷酸缓冲液5ml,混合均匀。另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。一起置于30C恒温水浴中，保温30分钟。4.吸取反应混合液2ml，加入呵噪乙酸试剂B4ml,摇匀，置于30 C的墨暗处保温30分钟，使显色。5.将显色后呈红色的反应液于分光光度计中测定吸光度，测定时用波长530nmo6.根据读数从标准曲线上查出相应的呵噪乙酸残留量（或从直线方程计算反应液中IAA的残留量）。7.从开始时加入的呵噪乙酸量减去酶作用后残留的呵噪乙酸量，即得被酶所分解破坏的呵噪乙酸量。以每ml酶液在1小时内分解破坏呵噪乙酸量（ 期）表示酶活力的大小

46、。8.配制浓度从025 Pg /ml的IAA溶液，分别测得吸光度A,然后绘制标准曲线，或 计算直线回归方程。36实验22 IAA的生物鉴定（小麦芽鞘切段伸长法）原理将小麦胚芽鞘的延长部分切成段，漂浮在含有生长素IAA的溶液中，这些切段可以继续伸长，在一定浓度范围内， 芽鞘切段的伸长与生长素浓度的对数成正比，因而可通过测定切段伸观多少来测定生长素的含量。仪器药品25C暗室滤纸旋转器分析天平小瓷缸大瓷缸忻皿银试管移液管青霉素瓶刀片小镶子尼龙网刻度尺半对数座标纸饱和漂白粉溶液小麦品种，扬麦1最好用中农28。100 ppmIAA母液：称10 mg IAA溶于少量无水酒精中，再用水稀释至100ml。此溶

47、液 在冰箱中可保存一个月。缓冲液：称取K2HPO4,1.7 94g,柠檬酸1.019g，蔗糖（AR）20g溶于1000ml重蒸储 水中，pH为5.0。操作步骤1.挑选大小均匀的小麦种子（必须用前一二年的种子，因当年新收的种子发芽不整齐）用饱和漂白粉溶液灭菌30分钟后，用自来水冲冼半天，放在盛肿湿润滤纸的培养皿中，腹 沟朝下，在25oC黑暗条件下萌发24小时。2.当第一胚根出现后，移于用尼龙网覆盖的小瓷缸中，胚根插入尼龙网眼，如图20所示。小瓷缸放入盛水的大瓷缸中，以保持湿度或在小瓷缸上罩上烧杯保湿。3.继续在25C黑暗下培养，约40小时后，当胚芽鞘长达3cm左右时，选取2.8-3.0cm37幼

48、苗作为生物鉴定材料，因这样大小的芽鞘对IAA最敏感。4.切去芽鞘尖端3mm取下面5mm段作试验，如图21所示。5.将5mm切段漂浮在重蒸储水中浸洗23小时，除去初段中内源激素。6.配制0.001、0.01、0.1、1.0、10 PPm的IAA的系列标准溶液（配在具塞试管中）。吸取100ppmIAA1ml + 9ml缓冲液pm IAA吸取10PPmIAA1ml + 9ml缓冲液m IAA吸取1PPmIAA1ml + 9ml缓冲液-Pm IAA吸取0.1PPmIAAml + 9ml缓冲液001 PPm IAA吸取0.01 PPm IAA1ml + 9ml缓冲液01 PPm IAA7.在具塞青霉素瓶

49、中分别吸入上述IAA系列标准溶液（0. 001、0. 01、1.0、10PPmIAA）2ml，另外吸取2ml缓冲浪作为对照。8.切段浸泡后，用滤纸将切段表面水分吸干，在上述盛有不同浓度生长素的青霉素瓶中，分别放入芽鞘切段10段（最好放11 12段，以便挑选）加塞，每一浓度重复3次。将青霉素瓶置于旋转器上（旋转速度为16r/min ）在25 C暗室中旋转培养。9.上述操作均需在暗室中绿光下进行。10.旋转培养20小时后取出芽鞘切段，在滤纸上吸干，测量芽鞘切段的长度。11.在半对数坐标纸上，以芽鞘切段增长为 纵坐标，IAA浓度为横坐标，作出标准曲线。在生长素浓度为0.001 1.0PPm范围内，切

50、段的伸长与生长素浓度的对数成正比，如需鉴定某一植物提取液中生长素含量，必须与标准的IAA作对照。处理长度一对照长度100 %原来长度*芽鞘切段增长 =38实验23细胞分裂素对萝卜子叶的保绿作用原理在植物中广泛存在着细胞分裂素， 细胞分裂素能够促进细胞分裂， 阻止核酸酶和蛋白酶 等一些水解酶的产生， 因而使得核酸、蛋白质和叶绿素少受破坏， 同时具有减少营养物质向 外运输的作用。将植物的离体叶片放在适宜浓度的细胞分裂索溶液中，置于25 30C黑暗条件下，叶片中叶绿素的分解速度比对照慢， 证明细胞分裂素具有保绿作用。 生产上可用细胞分裂素延 长蔬菜的贮藏时间。仪器药品721型分光光度计合天平忻皿容量

51、瓶小漏斗男力研钵0.lmol/L HCl6-节基氨基喋吟（或玉米素）溶液：称取10mg6-节基氨基腺喋吟，先用0.1mol/L HCl溶解，再用蒸储水稀释成100ml，则浓度为100 ppm再稀释成5、10、20 ppm,配成的溶pH约为5左右。操作步骤取4套培养皿分别加入蒸储水和5、10、20 ppm的6-节基氨基脓瞟吟溶液各20ml,每 种浓度处理重复2次。各培养皿中放入苗岭和长势相同的萝卜子叶1g,加盖后放在25 30 C黑暗的地方培养。1-2天后取出材料，用吸水纸吸干子叶上的溶液，然后按实验33的方法，测定各处理组子叶中所含的总叶绿素含量（mg叶绿素/g鲜组织）。39实验24乙烯对棉花

52、子叶脱落的效应原理乙烯能增强果胶酶和纤维素酶的活性，加速果胶质和纤维素水解，使得细胞间的结合力减弱，导致离层产生，引起器官的脱落。乙烯利（2-氯乙基麟酸）在植物细胞液的pH条件下（一般pH4）,缓缓分解放出乙烯,具有与乙烯相同的生理效应。仪器药品男刀镶子忻皿小烧杯脱脂棉乙烯利操作步骤1.取棉花幼苗植株一棵，剪去叶身留下叶柄，并将叶柄算短，如图24所示（也可以用 叶子对生的植物作为材料大于左右两边的叶柄切口上，包上少许脱脂棉，在右边切口棉花上滴1滴乙烯利溶液，左边切口上滴1滴蒸储水，乙烯利的浓度为10、5、1、0.5、0.05ppm。每一处理作2个重复，将所有处理的材料插在培养皿的湿沙中，24小

53、时后，用镶子轻碰叶柄，看是否脱落。以后每天早晚用镶子检查脱落，记下每个叶柄脱落所需的时间，比较所得结果。2.取叶子对生的植物枝条，留下三个节位，其余剪去，并将三个节位上的叶子，剪去叶身，留下叶柄。在中间一对叶柄切口包上少许脱脂棉，于右边切口滴上乙烯利，左边切口滴上蒸储水，乙烯利浓度为10、5ppm,将材料插在小烧杯蒸储水中，以后每日用镶子检查三对叶辆的脱落情况，比较所得结果。3.用不同浓度（10、5、1、0.5、0.05ppm）脱落欧作上述同样的试验，以观察对棉花 于叶的脱落效应。脱落敌用少量碳酸氢钠溶解，再用蒸储水稀释之。40实验25种子发芽率的快速测定种子发芽率是指在最适宜条件下，在规定大

54、数内，发芽的种子占供试种子的百分数。它是决定种子品质和实用价值大小的主要依据，与播种的用种量直接有关。 但是常规方法（直接发芽）测定发芽率所需时间较长，特别是有时为了应急需要，没有足够的时间来测定发芽 率，遇到休眠种子也无法知道。快速测定法则能在较短时间内获得结果。I氯化三苯四氮哇法（TTC法）凡有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的种胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH NADPH上41的氢还原时，便由无色的TTC变为红色的三苯基甲(TTE)。CeHs一CNKN-QHJ-TTC(无色)Cl心RC /+HC1、N=NC届仪器

55、药品恒温箱烧坏培养皿镶子刀片天平0.5%TTC溶液: 称取0.5gTTC放在烧杯中，加入少许95%醇使其溶解，然后用蒸储水稀释至100ml。溶液避光保存，若变红色，即不能再用。操作步骤1.浸种将待测种子在30 35C温水中浸种（大麦、小麦、釉谷6 8小时，玉米5小时左右，粳谷2小时），以增强种胚的呼吸强度，使显色迅速。2.显色取吸胀的种子200粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为二半，将其中的一半置于2只培养皿中，每皿100个半粒，加入适量的0.5%TTG以覆盖种子为度。 然后置于30 C恒温箱中420.5 1小时。观察结果，凡胚被染为红色的是活种子。将另一半在沸水中煮5分钟杀死胚，作同样染色处理

56、，作为对照观察。3.计算活种子的百分离，如果可能的话与实际发芽率作一比较，看是否相符?43实验26谷物种子萌发时淀粉酶活性的测定原理种了中的贮藏物质淀粉，在萌发过程中，主要是在淀粉酶水解作用下转变成简单的有机化合物，这些物质是构成新器官的材料。在一定条件下定量淀粉糖化过程时间的长短即可 表示酶活力的大小。仪器药品天平恒温水浴锅研钵白磁板漏斗漏斗架培养皿滤纸1%淀粉溶液0.2mol/L磷酸缓冲液，Ph6I-KI溶液：1.原碘液：1211g, KI22g,定容至500ml。2.标准稀碘液：取原碘液15ml，加KI8g定容至500ml。3.比色稀碘液：原碘液2ml加KI20g，定容至500ml。标准

57、糊精：称取0.12g糊精，悬浮于少量水中，再移至沸水中，冷却定容至200ml,取其中1ml加3ml标准稀碘液作为比较颜色。操作步骤1.实验材料的准备于实验前6天，采用水培法培养出几种不同环境条件下生长的作物幼苗（水稻、小麦）。2.淀粉酶溶液的制备将不同幼苗用水洗净，各种取幼苗胚乳部分0.5g,分别置于研钵中，加5ml pH6的磷酸缓冲液，仔细研磨，滤纸过滤（或离心），用适量缓冲液冲洗，最后定容至10ml。3.保温糖化取20ml 1%淀粉液和5ml pH6的磷酸缓冲液于三角烧瓶中，置于35C水浴中平衡15分钟，加1ml制备好的酶溶液，搅匀，立即记时间。444.显色、观察及测定吸上述混合液1滴于白

58、瓷反应板上，加1滴稀碘液，观察颜色，与标准糊精比较颜色,相同即是反应达到终点，记录糖化时间to计算：Ua=牛 20 1% ff为稀释倍数(20) oUa为酶活力单位(表示每g材料每小时消化1g淀粉的酶活力为1个单位)。45实验27植物组织培养植物组织培养是把植物的器官，组织以到单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下， 能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞， 又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞图，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成辅导 系统以及根和芽等组织和器官，这一过程

59、称为“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要作用，呵噪乙酸和6-节基氨基腺喋吟的比例，决定了根和芽的分化。近年来，组织培养作为一种研究技术，已广泛地应用于许多学科中，它不仅对理论研究有重要意义，并已展现了十分广阔的应用前景。I .愈伤组织培养和分化原理植物组织经过脱分化作用， 形成愈伤组织，经过再分化作用， 愈伤组织又能重新分化为 有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在1957年Skoog即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。仪器药品培养室接种箱或超净工作台局压灭凿锅分析天平水浴锅长镶子解剖刀男力三角饶瓶（100ml）容量瓶烧杯移液管量简牛皮纸忻皿称量纸

60、棉线HgCl2（或次氨酸钠）乙醇6-苯基氮基腺喋吟IAA或2, 4-DMS培养基（见附表16和17）操作步骤461.配制培养基（1）愈伤组织诱导培养基：MS培养基（蔗糖含量为10g/L , 2, 4-D含量为2mg/L,琼脂I0g/L）。（2）试验培养基: 按下表配制。序号呵噪乙酸（mg/L）6-茉基氨腺喋吟相对比值102.020.22.01:1030.52.01:441.02.01:252.02.01:162.01.02:172.00.54:182.00.210:192.00呵噪乙酸用少量0.1mol/L NaOH溶解，6节基氨基腺瞟吟用少量0.lmol/L HCI溶解。2.培养基灭菌将配好