免疫逃避型人胰岛类器官改善糖尿病

1、免疫逃避型人胰岛类器官改善糖尿病导读干细胞来源的胰岛有望成为治疗胰岛素依赖型糖尿病的有效策略，但仍面临挑战。本研究诱导多能干细胞产生人胰岛类器官（HILO），驱动非经典的WNT4信号促进其代谢成熟。这些功能成熟的HILO包含内分泌类细胞，且移植后可在糖尿病NOD / SCID小鼠中快速重建葡萄糖稳态。PD-L1的过表达保护HILO异种移植，使它们能够在具有免疫活性的糖尿病小鼠中复原葡萄糖稳态达50天。此外，IFN-离体刺激可诱导内源性PD-L1表达，并抑制T细胞活化和移植排斥。这类能够逃避免疫检测的葡萄糖反应性胰岛类器官的产生，为尸体和设备依赖的糖尿病治疗提供了极具前景的替代方案。结果1

2、60;WNT4诱导HILOs的功能成熟胰岛移植可为1型和2型晚期糖尿病患者提供长期有效的血糖，但尸体来源的胰岛因质量和可利用性而限制了其实用价值。尽管诱导性多能干细胞（iPS细胞）向胰岛样细胞的分化取得重大进展，但产生适合于人类治疗的功能性样细胞仍待探究。研究者先前证明核雌激素相关受体（ERR）能够驱动葡萄糖刺激下细胞胰岛素分泌（GSIS）所必需的产后代谢成熟。ERR在iPS来源的样细胞中的过表达足以实现体内/外功能。为了产生适合移植的功能性细胞，研究者探索能够复制细胞结构以及胰岛细胞类型多样性的培养条件。最初利用人类脂肪干细胞（hADSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（分别模拟胰腺成

3、纤维细胞和胰腺内皮细胞）在三维（3D）培养和多糖悬浮凝胶培养中形成器官和血管结构的固有能力。在人类iPS细胞（hiPS细胞）衍生的内分泌祖细胞分化过程中掺入hADSCs和HUVECs，可形成与人类胰岛大小相当的多细胞球体（MCSs）。与不存在hADSCs和HUVECs的情况相比，MCSs中ESRRG（编码ERR）和线粒体基因NDUFA1和COX7A2的表达增加，这也与体外葡萄糖刺激后胰岛素分泌升高有关。在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病NOD / SCID小鼠中，移植到肾囊中的MCSs能够维持葡萄糖稳态约40天，显示出与人胰岛移植相似的效果，且移植的MCSs仍对葡萄糖具有反应性。这些结果均表明

4、3D多细胞相互作用在器官发生中具有重要作用。在hADSC自组装过程中发生的转录变化基因本体（GO）分析显示富集的代谢和细胞因子信号以及WNT信号途径。在小鼠胰岛的产后功能成熟过程中WNT4的表达增强，并且非经典的WNT途径可诱导人胰岛的细胞成熟并增加GSIS，此外，WNT4在人类胰岛中高度表达。人类胰岛的单细胞测序表明WNT4在和细胞中的广泛表达。基于此，研究者认为WNT信号传导足以支持iPS细胞衍生的离体样细胞的功能成熟。为此，利用CRISPRCas9生成显示内源胰岛素启动子活性的报告基因。在3D培养系统中对这些改造的hiPS细胞进行分化，并在最后的成熟步骤中掺入WNT4，可诱导表达胰岛素的

5、人胰岛类器官（HILO）的形成（图1a，b）。此外 HILOs高表达尿皮质激素-3（UCN3）和胰岛素。电子显微镜显示HILO与人类胰岛结构相似，最重要的是胰岛素和胰高血糖素颗粒的存在（图1c）。比较转录分析显示WNT4处理的HILO（wHILO）和人类胰岛中多个关键胰岛细胞标记物的表达相似，如细胞特异性（NKX6-1，NEUROD1，RFX6，GCK，ISL1，SYT4和PDX1）和-细胞特异性（ARX）基因，而INS，MAFA，MAFB，UCN3和NKX2-2表达较低（图1d）。加入WNT4不会改变细胞谱系特异性标志物的表达（如INS，NKX6-1，UCN3，MAFB和SYT4），这表明W

6、NT信号传导不会影响细胞命运的确定。但WNT4以剂量依赖方式增加了HILO中ESRRG以及线粒体呼吸链NDUFA7和COX7A2的表达（图1e），与基因表达的变化一致。在WNT4存在条件下衍生的 HILO其氧化代谢增加，这也与健康人类胰岛的代谢特征一致（图1f）。WNT4处理的HILOs表现出改善的体外GSIS，且不能被-连环素抑制剂（XAV939）所阻断，暗示非经典的WNT信号是诱导细胞成熟的驱动力（图1g）。在多能HuES8和H1ES细胞的分化和成熟过程中观察到类似的转录和功能变化，表明此方案的稳定性。在含有WNT4的3D分化培养基中培养商业化的hiPS衍生的样细胞，也可促进伪胰岛的形成和

7、GSIS功能。在STZ诱导的NOD / SCID糖尿病小鼠中移植wHILOs恢复了其血糖控制，并维持了葡萄糖稳态超过六周。总之，这些结果表明非经典的WNT信号足以诱导HILOSs代谢成熟，这也是GSIS所必需的。为明确驱动HILOs成熟的分子机制，研究者鉴定在WNT4处理所诱导的转录变化。WNT4处理增加了1,581个基因的表达，并减少了1,354个基因的表达。基因本体（GO）分析明确了代谢途径，最为显著的是氧化磷酸化，在上调的基因组中富集（图1h），与对细胞代谢的影响一致。WNT4处理可将HILOs中OxPhos基因的表达完全提高至与人类胰岛相似的水平，并增加线粒体含量（图1i）。为了检测样

8、细胞群体中的特定影响，在有/无 WNT4或WNT5a处理HILOs时，基于HILOs 的GFP表达，对分泌胰岛素的细胞进行分类。胰岛素分泌细胞比例不受WNT处理的影响，与HILOs成熟期恒定的细胞谱系标志物的表达一致。但WNT4和WNT5a处理增加了胰岛素分泌细胞中的线粒体质量，这也支持线粒体支撑样细胞代谢成熟的观点。为了鉴定该成熟步骤的遗传效应，利用 ATAC-seq在分选的GFP +细胞中WNT4诱导的染色质可及性变化进行分析，可观察到广泛的染色质可及性的微小变化。利用GO对WNT4处理后表达量和染色质可及性增加的123个基因进行分析，明确了代谢途径（包括氧化磷酸化），而对该基因子集的基序

9、分析确定了包括FOXA2和ERRs在内的细胞成熟因子。此外WNT4可诱导从野生型而非ERR 细胞特异性基因敲除小鼠（ERRKO小鼠）中分离的新生儿胰岛中，线粒体代谢基因的表达并改善GSIS功能。总之，这些结果表明非经典的WNT4信号传导可增强线粒体功能，且很大程度上是通过诱导ERR基因网络（驱动样细胞的代谢成熟）来实现（图1）。图1. WNT4诱导HILOs功能成熟。a，产生HILOs的示意图，图中显示了每个发育过程中需添加到培养基中的关键因素，上下箭头分别表示激动剂和抑制剂。DE，定形内胚层；EP，内分泌祖细胞；FG，后前肠；PP，胰腺祖细胞。Act, 激活素A；RA，视黄酸；VitC，维生

10、素C；VitE，维生素E; ALK5也称为TGFBR1。b，3D培养中HILOs图像（左）和人胰岛素启动子驱动的胰岛素表达（右，由GFP指示）。c，wHILOs和人胰岛的电子显微镜图，显示了胰岛素和胰高血糖素颗粒。d，在hiPS细胞，经PBS（-）或rhWNT4（+）处理的HILOs和人胰岛中关键胰岛基因相对表达的热图。e，用梯度浓度的WNT4处理后，HILOs中ESRRG，NDUFA7和COX7A2基因的相对表达。f，测量在hiPS细胞球状体（0天，紫色），PBS处理的HILOs（绿色），WNT4处理的HILOs（红色）和人胰岛（蓝色）中的耗氧率（OCR）。g，体外HILOs在不同刺激条件下

11、人C肽分泌的情况，如体外人C肽分泌对（G3）或20 mM葡萄糖（G20）或20 mM KCl（K20）刺激。h，HILOs中WNT4调控基因的GO分析。富集途径中的上调和下调基因分别以红色和蓝色圆点显示。i，3D培养的hiPS细胞，HILOs，wHILOs和人胰岛中氧化磷酸化基因相对表达的热图。 2 成熟HILOs 的细胞复杂性免疫组织化学和流式细胞仪分析显示5060的wHILO细胞共表达胰岛素和细胞标志物，并鉴定出少数表达其他内分泌细胞标志物（如胰高血糖素，生长抑素，胰腺多肽）的细胞群（图2a）。WNT4处理并不会改变HILO的细胞组成，这与转录分析一致。为了表征代谢成熟

12、HILOs的细胞复杂性并了解其体外成熟程序，研究者比较了HILOs（PBS处理）和wHILOs（WNT4处理）单细胞转录组。wHILOs聚类分析发现了一类富含细胞标记物和SOX9 + HES1 +的胰腺祖细胞簇。特征基因表达分析进一步区分了非复制和复制性导管内分泌双能细胞（TOP2A±），内分泌素富集的细胞（GCG +或SST +），导管样细胞（KRT19 +）和少量功能未知的细胞。综合的HILO和wHILO单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据聚类表明在样细胞簇其谱系标记INS，NEUROD1，NKX6-1和PDX-1的表达非常相似。相比之下， WNT4处理INS + ESRR

13、G +细胞，其ESRRG及其靶线粒体基因NDUFV3的表达增加，而糖酵解基因LDHA减少。对wHILOs和人胰岛单细胞数据集的类似综合分析证实了多种内分泌样细胞类型的存在（图2b）。尽管差异显著，wHILOs能与胰岛内分泌细胞（-，-，-和-细胞）聚类，暗示其转录相似性（图2b）。值得注意的是，与胰岛细胞共聚类的功能分类显示wHILOs中主要存在样和样细胞（图2b）。图2. 外源性PD-L1表达在免疫能力强的小鼠中扩展了wHILO功能。a.胰高血糖素的代表性免疫荧光染色(GCG；细胞标志物)、生长抑素(SST细胞标志物)和胰腺多肽(PP；细胞标记)。细胞由胰岛素启动子的绿色荧光蛋白表达来指示。

14、（比例尺，75m。右侧，方框区域的扩展。）b，T-分布式随机邻居嵌入(t-SNE)聚类组合wHILO(蓝点，n = 4，840)和人胰岛(红点，n = 3，245)单细胞转录组(左)和由该聚类分析定义的细胞类型(左)。c，实验方案示意图。高剂量STZ (HD-STZ，180mg·kg-1)诱导的糖尿病C57BL6J小鼠接受有或无PD-L1过度表达(n = 500)的wHILOs或小鼠胰岛移植。d，移植有或无PD-L1表达的wHILOs(分别为11和9)和C57BL6J胰岛(7)后随机喂养的血糖水平。e，流式细胞术分析在移植有或没有PD-L1表达的wHILOs后27天从肾被膜移植物中回

15、收的胰岛素表达和小鼠免疫(CD45+)细胞(n = 6)。显示每个区域中的细胞百分比。数据为平均标准差*P<0.05，P < 0.01，*P<0.001单尾配对学生测验。图像是三个独立实验的代表。数据具有代表性(e)，或由三个独立样本(b)或实验(d，f)汇编而成。 3  wHILOs具有免疫耐受性 PD-L1为 wHILOs提供免疫保护。移植胰岛的临床实用性受限于同种异体和自身免疫反应。正常胰岛中的细胞子集包括少量表达PD-L1的细胞，PD-L1是细胞免疫耐受的决定因素，暗示外源性PD-L1表达可保护wHILOs免受免疫排斥。为此，利

16、用慢病毒系统生成表达PD-L1的hiPS细胞克隆，随后分化为代谢成熟的wHILOs，但PD-L1过表达不影响胰岛素分泌。将具有/不具有PD-L1表达的wHILOs移植到具有免疫活性的糖尿病小鼠中，在移植后的几天内恢复了血糖控制，且与STZ处理的C57BL6J小鼠相似（图2c，d）。然而，PD-L1缺乏的wHILOs功能逐渐消失，因其血糖水平逐渐升高，而PD-L1 + wHILOs能够维持葡萄糖稳态超过50天（图2d）。此外，增加PD-L1 + wHILOs数量可使血糖水平正常化超过50天。对移植27天后恢复的移植物进行流式细胞术分析，结果显示PD-L1 +移植物中CD45 +免疫细胞（包括T细

17、胞和自然杀伤细胞）的数量减少，而胰岛素表达的细胞数量微乎其微（图2e，f）。PD-L1 + wHILOs作为异种移植物的持久性促使研究者在包含重组人T细胞库的模型中探索其功能。在人类T细胞存在条件下，多次低剂量STZ处理（MLD-STZ）使HuPBMS-NSG-SGM3小鼠患上糖尿病，随后将wHILOs移植至小鼠内（图3a，b）。与缺乏PD-L1表达的人相比，移植的PD-L1 + wHILOs提供了持续的血糖控制和人C肽水平（人C肽水平与血糖控制程度相关）（图3c，d）。外科手术摘除移植肾后高血糖症迅速发展，表明移植物衍生的胰岛素是主要的作用因子（图3c）。对恢复后移植物的后续分析显示，非免疫

18、隔离的wHILOs中表达胰岛素的细胞数量显著减少，而人淋巴细胞相应增加（图3e，f）。图3. wHILO（PD-L1）有助于人源化小鼠的葡萄糖控制。a，实验流程图，显示将有和没有PD-L1过表达的wHILOs移植到多个低剂量STZ诱导的糖尿病人源化小鼠（Hu-PBMC-NSG）中。 b，流式细胞仪分析Hu-PBMC-NSG小鼠(人PBMC移植后3周)的外周血单核细胞（PBMC）中的人T细胞占比。c，移植有或没有PD-L1表达的wHILOs后，MLD-STZ诱导的糖尿病Hu-PBMC-NSG小鼠de 血糖水平。 d，c,小鼠血清中人C肽水平。 e，在移植有或没有PD-L1表达的wHILOs后27

19、天，从肾囊移植物中回收的表达胰岛素和人CD45 +免疫细胞的流式细胞仪分析。 f，e, 流式数据的相对定量分析。 表观遗传记忆驱动wHILOs免疫耐受。干扰素-（IFN-）刺激可以诱导多种细胞、癌症和胰岛中PDL1的表达；然而长期暴露的细胞因子（包括IFN-）会诱导细胞死亡和/或去分化。为了确定该途径是否可以使宿主的免疫反应最小化，研究者首先将人胰岛暴露于IFN-。IFN-处理12小时后，PDL1（也称CD274）表达增加了约20倍。wHILOs实验看到了类似的诱导作用，即IFN-诱导胰岛素表达细胞/非表达细胞（分别为GFP +/GFP-细胞）中PDL1的表达（图4a）。wHILOs

20、的剂量递增研究表明暴露于10 ng ml-1IFN-，12 h后 PDL1产生量最高。即使在此浓度下暴露2 小时也足以诱导PDL1，但该表达是瞬时的（图4b）。鉴于对炎性刺激（如LPS）的耐受性与表观遗传学变化相关联，就进一步探究连续IFN-刺激是否可以诱导持续的PDL1表达。其后反复的短时间暴露于IFN-（多次脉冲式刺激（MPS）也导致PDL1持续表达并伴随蛋白水平的增加（图4c-e）。值得注意的是，MPS IFN-处理不会损害GSIS功能（图4f）。此外，MPS IFN-处理的wHILOs免受 IL-1诱导的细胞去分化，由细胞标志INS和UCN3的高表达所示（图4g，h）。

21、60;  为了进一步对IFN-驱动wHILOs的变化的机制探讨发现，ATAC-seq分析显示急性（12小时）暴露IFN-和MPS IFN-处理诱导的全基因组转录变化与染色质可及性的改变有关。两种IFN-处理方法诱导的上调基因组中，大部分相互重叠，而下调的基因有一半受它们的共同影响。对共同上调基因组的GO分析明确了IFN-信号通路。在仅MPS组上调的基因组中发现了反映细胞炎症状态的通路，包括对IL-1的负调控和炎症通路，而在MPS下调的基因组中发现了正向调控NF-B信号传导和凋亡的基因。染色质可及性的重叠区的变化揭示了MPS IFN-处理后基因位点（包括PDL1，IRF9，J

22、UNB和JUND）的持续增加，这与基因转录水平的持续增加相一致。尽管急性处理后， IFN-反应性基因可及性增加（如IRF1和STAT1），但MPS处理时并未观察到上述现象。 研究者进一步研究MPS IFN-处理，在（具有免疫活性的）STZ诱导的糖尿病（C57BL6J）小鼠中产生免疫逃逸wHILOs（wHILOie）的能力。wHILOie移植能够降低葡萄糖水平长达40天，而原始的wHILOs（未暴露于IFN-）的降糖能力逐渐降低，这与血清中人类C肽水平的降低相一致（图4i-k ）。移植到人源化糖尿病小鼠中观察到相似的结果，且手术切除受体肾脏可导致血糖控制能力的突然丧失。若恢复wHILOie移植物，可观察到表达胰岛素的细胞数显著增加，伴随淋巴细胞浸润的减少和活化的Th细胞相对数量的减少（图4）。图4. 内源性