感染性克隆的发展及应用

1、感染性克隆与反向遗传操作感染性克隆与反向遗传操作l感染性克隆感染性克隆 病毒的感染性克隆是一种对于真核细胞具有感染性病毒的感染性克隆是一种对于真核细胞具有感染性 的病毒基因组全长克隆的质粒形式的病毒基因组全长克隆的质粒形式 将病毒基因组的全长将病毒基因组的全长DNADNA或或cDNAcDNA克隆整合到载体中克隆整合到载体中 能在能在E.coliE.coli中稳定存在和复制中稳定存在和复制 通过体外转录成通过体外转录成RNARNA或直接转染后或直接转染后, ,具有感染真核细具有感染真核细胞的能力胞的能力 因此，它既能在原核细胞中存在也能在真核细胞中因此，它既能在原核细胞中存在也能在真核细胞中增殖

2、传代增殖传代. .概述概述反向遗传学反向遗传学(Reverse Genetics)(Reverse Genetics)是相对于经典遗传是相对于经典遗传学而言的。学而言的。经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的，反向遗传学则是直接究生命的发生与发展规律的，反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作技术技术(Reverse Genetic Manipulaton)(Rever

3、se Genetic Manipulaton)。感染性克隆与反向遗传操作的发展开创了病毒研究感染性克隆与反向遗传操作的发展开创了病毒研究的新时代的新时代l感染性克隆与反向遗传操作为研究病毒生命感染性克隆与反向遗传操作为研究病毒生命行为、致病机制以及病毒与宿主细胞间的相互行为、致病机制以及病毒与宿主细胞间的相互作用提供了技术平台作用提供了技术平台l借助基因组感染性克隆来研究病毒，不再是借助基因组感染性克隆来研究病毒，不再是脱离病毒整体孤立地研究单个基因、单个蛋白，脱离病毒整体孤立地研究单个基因、单个蛋白，而可以从整个基因组水平来研究错综复杂、相而可以从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的基因

4、组合蛋白组互关联的基因组合蛋白组病毒感染性克隆发展及应用技术支撑病毒感染性克隆发展及应用技术支撑重组重组DNADNA技术技术RT-PCRRT-PCR技术技术体外转录技术体外转录技术人工诱变技术人工诱变技术病毒病毒RNARNA的提取技术的提取技术异硫氰酸胍分离技术已逐渐被商品化的异硫氰酸胍分离技术已逐渐被商品化的RNARNA分离试剂盒所替代分离试剂盒所替代试剂盒可以得到高纯度和高浓度的试剂盒可以得到高纯度和高浓度的RNARNA可以减少环境污染导致的可以减少环境污染导致的RNARNA降解降解RT-PCRRT-PCR技术技术两步法两步法一步法一步法超长超长RT-PCRRT-PCR体外、体内转录技术体

5、外、体内转录技术体外转录技术是利用体外转录技术是利用RNARNA聚合酶将基因组聚合酶将基因组cDNAcDNA拷贝转录成拷贝转录成RNARNA体内转录是将体内转录是将cDNAcDNA返回到返回到RNARNA的过程转移到的过程转移到细胞内完成细胞内完成人工引入转录终止。又称为流产转录人工引入转录终止。又称为流产转录（runoff transcription),runoff transcription),是人为在基因组是人为在基因组全长全长cDNAcDNA克隆克隆3 3端终止端终止RNARNA聚合酶的合成作用聚合酶的合成作用定点诱变技术定点诱变技术单点诱变单点诱变多点诱变多点诱变体外、体内转录技术体

6、外、体内转录技术体外转录技术是利用体外转录技术是利用RNARNA聚合酶将基因组聚合酶将基因组cDNAcDNA拷贝转录成拷贝转录成RNARNA体内转录是将体内转录是将cDNAcDNA返回到返回到RNARNA的过程转移到的过程转移到细胞内完成细胞内完成人工引入转录终止。又称为流产转录人工引入转录终止。又称为流产转录（runoff transcription),runoff transcription),是人为在基因组是人为在基因组全长全长cDNAcDNA克隆克隆3 3端终止端终止RNARNA聚合酶的合成作用聚合酶的合成作用lRNARNA病毒的感染性克隆病毒的感染性克隆lDNADNA病毒的感染性克隆

7、病毒的感染性克隆基因组基因组50kbDNA50kbDNA50kbDNA病毒的感染性克隆病毒的感染性克隆正链正链RNARNA病毒的感染性克隆病毒的感染性克隆负链负链RNARNA病毒的感染性克隆病毒的感染性克隆 分节段与不分节段负链分节段与不分节段负链RNARNA病毒的病毒的感染性克隆感染性克隆DNADNA病毒感染性克隆发展及应用病毒感染性克隆发展及应用DNADNA病毒感染性克隆的产生病毒感染性克隆的产生在在19791979年年,Israel,Israel等在等在E.coliE.coli中克隆了一种中克隆了一种小的哺乳动物病毒小的哺乳动物病毒(polyomavirus)(polyomavirus)

8、的全长的全长基因组基因组. .该病毒约该病毒约5kb5kb的双链的双链DNADNA基因组通过限制性基因组通过限制性酶切被连接到酶切被连接到pBR322pBR322质粒中质粒中. .当被克隆的病毒基因组当被克隆的病毒基因组DNADNA从从E.coliE.coli载体中载体中释放再接种小鼠或体外转染鼠细胞后均能释放再接种小鼠或体外转染鼠细胞后均能产生病毒感染产生病毒感染. .“感染性克隆感染性克隆”由此产生由此产生. .已构建感染性克隆的已构建感染性克隆的DNA病毒病毒 人腺病毒人腺病毒(HADV) , (1986)(HADV) , (1986) 杆状病毒杆状病毒 鼠巨细胞病毒鼠巨细胞病毒(MCM

9、V), (1997)(MCMV), (1997) 单疱疹病毒单疱疹病毒-1(HSV-1), (1998)-1(HSV-1), (1998) 猪伪狂犬病毒猪伪狂犬病毒(PRV), (1999)(PRV), (1999) 人巨细胞病毒人巨细胞病毒(HCMV), (1999)(HCMV), (1999) 马立克氏病毒马立克氏病毒-1(MDV-1), (2000)-1(MDV-1), (2000) 几内亚猪巨细胞病毒几内亚猪巨细胞病毒(GPCMV), (2000)(GPCMV), (2000) 鼠鼠疱疹病毒疱疹病毒-68(MGHV-68), (2001)-68(MGHV-68), (2001) 牛疱疹

10、病毒牛疱疹病毒-1(BHV-1), (2001)-1(BHV-1), (2001) 猕猴巨细胞病毒猕猴巨细胞病毒(RCMV), (2002)(RCMV), (2002) 牛痘病毒牛痘病毒(VAC), (2002)(VAC), (2002)E.coli致育因子致育因子(fertility,F) F F因子是一个约因子是一个约100kb100kb的质粒的质粒, ,编码编码6060多种参多种参与复制与复制、分配和接合过程的蛋白质分配和接合过程的蛋白质 F F+ +性状作为染色体的标记性状作为染色体的标记, ,可以高效地转移可以高效地转移给受体细胞给受体细胞(F(F- -),),提示接合转移需要一个可

11、提示接合转移需要一个可传递的致育因子传递的致育因子, ,该因子被命名为该因子被命名为F.F. F F因子可以整合到宿主染色体中因子可以整合到宿主染色体中, ,并且以超并且以超常的高频率转移遗传标记常的高频率转移遗传标记. .F F因子的生物学特性因子的生物学特性低拷贝数低拷贝数(1-2(1-2个分子个分子/ /细胞细胞) )，低拷贝数加，低拷贝数加上细胞的隔绝环境上细胞的隔绝环境, ,限制了细胞内质粒分子限制了细胞内质粒分子间的重组间的重组能容纳非常大。自然发生的能容纳非常大。自然发生的F F因子能携带因子能携带1/41/4的的E.coliE.coli染色体而不显张力或不稳定。染色体而不显张力

12、或不稳定。易于操作。由于易于操作。由于F F因子呈闭环结构因子呈闭环结构, ,所以可所以可以用一些常规的原核基因操作技术将它直以用一些常规的原核基因操作技术将它直接从接从E.coliE.coli中分离出来。中分离出来。人工染色体人工染色体(artificial chromosome)(artificial chromosome)的发展为的发展为DNADNA病毒感染性克隆与反向遗病毒感染性克隆与反向遗传操作的建立奠定了技术基础传操作的建立奠定了技术基础. .F F因子的特性使其作为基因组因子的特性使其作为基因组DNADNA的高容量载体具有独特的魅力的高容量载体具有独特的魅力. . 1987198

13、7年年, ,克隆容量可达几百甚至上克隆容量可达几百甚至上 千千kbkb的的酵母人工染色体酵母人工染色体(Yeast artificial (Yeast artificial chromosome,YAC)chromosome,YAC)问世问世, ,使通过同源重组的使通过同源重组的方法在酵母中对基因组大片段的操作成为方法在酵母中对基因组大片段的操作成为可能。但是可能。但是,YAC,YAC内部存在嵌合及重组内部存在嵌合及重组YACYAC19891989年，年， O OConnerConner首次用首次用“染色体建造染色体建造”的方法，的方法，利用利用F F因子构建载体因子构建载体pMBO131pM

14、BO131来克隆大片段来克隆大片段DNA.DNA.BACBAC19921992年年, Shizuya, Shizuya等以等以pMBO131pMBO131为基础为基础, ,将将T7T7、SP6SP6启动子序列，含启动子序列，含cosNcosN和和loxPloxP位点的位点的和和P1P1噬菌体片噬菌体片段分别插入段分别插入pMBO131pMBO131中，构建了可以容纳中，构建了可以容纳300kb300kb以上以上的载体的载体pBAC108LpBAC108L，从而建立了细菌人工染色体，从而建立了细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC) (bacter

15、ial artificial chromosome,BAC) 。发展中的细菌人工染色体发展中的细菌人工染色体BACBAC载体的基本结构载体的基本结构parA parA 、parBparB和和parC,parC,分裂必需的分裂必需的3 3个基因个基因oriSoriS决定决定DNADNA的单向复制的单向复制repErepE编码复制所必需的蛋白质编码复制所必需的蛋白质E.E.CmCmr r ( (氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因),),选择性标志基因选择性标志基因lacZlacZ元件元件, ,通过通过互补的原理区分重组子互补的原理区分重组子cosNcosN和和loxPloxP，分别来源于，分别来源于和和

16、P1P1噬菌体。其中噬菌体。其中cosNcosN可被可被噬菌体的末端酶切割，噬菌体的末端酶切割，loxPloxP可由可由P1P1噬噬菌体的菌体的CreCre蛋白识别和切割蛋白识别和切割BAC载体骨架图谱载体骨架图谱其它人工染色体其它人工染色体PACPAC：来源于：来源于P1P1的人工染色体的人工染色体 ( (容量容量300kb300kb）HACHAC：哺乳动物人工染色体：哺乳动物人工染色体( (容量容量300kb6.55.54.86.4Replica-tionThe mutation of D to N at position 701 in PB2 enables DK/22 to infec

17、t and kill miceMLD50 (lgEID50 )PB2PB1PAHANPNA MNSReplicationDKGX/22Virus6.51.8R-DKGX/356.52.3R-DKGX/22DKGX/35Two rescued viruses maintained the biological properties of the wild type virusesGenotypeMLD50 (lgEID50 )PB2PB1PAHANPNA MNSReplica-tionDKGX/22VirusGenotype6.5GX/22-35PB2GX/22-35PB1GX/22-35PAG

18、X/22-35HAGX/22-35NPGX/22-35NAGX/22-35MGX/22-35NS4.36.56.56.56.56.56.56.5PB2 of GX/35 allows GX/22 to infect and kill miceMLD50 (lgEID50 )PB2PB1PAHANPNA MNSReplica-tionVirusGenotype1.81.7GX/35-22PAGX/35-22HAGX/35-22NPGX/35-22NAGX/35-22MGX/35-22NS6.35.22.83.23.72.84.5DKGX/35GX/35-22PB1GX/35-22PB2PB2 of GX/22 attenuates GX/35 virusMLD50 (lgEID50)153105108TA AN DVirusR-GX/22Chimera-1R-GX/35Chimera-2Chimera-3699A TDK N701Chimera-4PB2Other genesGX/22GX/35GX/22GX/22GX/35GX/356.52.36.5