实验报告三免疫印迹

1、实验三：免疫印迹1原理免疫印迹又称VCusirrn印迹0X7cslcrn blotting）,与DNA的Southern印迹技术相 对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种冏相载体（通常为NC膜）， 然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotring所检测的是抗原类罢白质 成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶番白所星现的抗原表位发生 特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和网相免疫测定特异敏感等谙多优 点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中 检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的周相放射免疫分析的 水平而无需对

2、耙番白进行放射性标记。冃前，Wus tern blotring广泛用于罢白质研究、 基础研究和临床医学的研究。免疫印迹可分成两个步骤：罢白质由凝胶转移至周相基质；特异性抗体检测。 罢白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1半干法：将凝胶和周相 基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-3（）分钟可完成转移；2湿法： 将凝胶和冏相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜 课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜 两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。转移结束后，丟白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体 孵

3、育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的笫二抗体（二 抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过囊化物语等标记物。目的页白可由该诲催化 的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是酶标抗IgG,故不加一抗。 2试剂与仪器2.1试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1转移缓冲液Tris 3.025莒甘氨酸14.413若甲醇 20mL加蒸芻水约800mL,调pH至8.3,定容lOOOmL2.1.2 Tris缓冲盐溶液（TBS）Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸镭水约800mL,调pH至7.5,定容lOOOmL2.13 TTBSTBS 800mLTwccn-20 40()pl2

4、.1.4封闭液及抗体稀释液脫脂奶粉0.3gTBS lOOmL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺(DAB) 5.0mgTBS 18mLH2O22()pl 临用前配2.1.6丽拳红总页白质染色液丽春红1若4% 乙酸 lOOmL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至15()mL2.1.8 诲标抗 IgG (1: 1500)晦标抗IgG O.lmL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9on培养皿，剪刀，银子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3试验步骤3.1 SPS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，

5、故此处从略。不同之处如下：3.1.1样品制备：取人血清0.1ml,加稀释5借的上样缓冲液0.5ml,振摇后 10(X)0rp/5min离心，取80j.il上清液加入等体积的样品缓冲液，在沸水浴中加热3min。 瞬间离心，取上清液上样。3.1.2加样：拔出梳子，用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。上样量从左到右为5、2（）、15、10、5、5、5、5、1（）、15、20、5讪（从中间分开，两侧对称）。3.1.3电泳：稳流10mA电泳，当渎酚蓝指示剂前沿到达距底部1cm左右时，停止 电泳。取出胶，将点有样品的胶条从中间切成两条，一条用常规方法染色和脫色， 另一条用于转移和语联。3.2转移番白质到硝酸纤维

6、素膜上（电转移）321切割与.胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液浸泡5min使没有气泡。 322剪2张滤纸与胶尺寸大小相符，将其与海绵一起浸泡在转移缓冲液中。323打开转移槽的胶扳，依次放入：乩一张漫湿的海绵；b. 一张用转移缓冲液 饱和的滤纸；c.用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心的赶走滤纸和胶之间的气泡； d.硝酸纤维素膜，正面对着胶，在胶和膜的右下角剪一小角，以标明方向；c一 张用转移缓冲液饱和的滤纸；f一张浸湿后的海绵。324小心的合上胶板，并立即放入转移电泳槽中。加转移缓冲液至满。325插好电极，注意正负极方向，胶侧为负，NC膜侧为正。打开电泳仪开关调 至稳压60v,电泳2h,转移结

7、束后打开胶扳取出硝酸纤维素薄膜。3.3膜的晦联免疫染色3.3.1用丽春红溶液检验转移是否成功，若显色清楚，用蒸镭水冲洗，TBS洗濮Imino3.3.2将膜放入培养皿中。加封闭液后在37°C摇床上摇动60mino3.3.3取出膜，用TTBS洗膜3次，每次3min,将膜放入另一个培养皿中。3.3.4在培养皿中加入用150ml5%小牛血清生理盐水配制的1: 1500的酶标IgG, 在冰箱中振荡过夜。3.3.5 取出膜，用TTBS洗3次，每次3min,晟后用TBS溶液洗1次，以去除TwcCn-20o3.3.6将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，取出濮，将胶制成干扳。4实验结果4.1 S

8、PS-PAGE电泳分离结杲（图1右）上样量为1（）M的泳道分离效果较5川的泳道好，共出现4个较清晰的条带。4.2显色后的免疫印迹膜（图1左）在免疫印迹膜上共检测出一条带e,应该为球餐白，对应于右图中的c。人血淸蛋白10 5/glCi 一图1: SDS-PAGE电泳分离结果（右图）和显色后的免疫印迹膜（左图），图上所标的数宇分别为每一个泳道的上样量（单位/M）5 讨论5.1本实验所用的样品是人血清，人血清的成分非常复杂，BioPharm International （2003）报道:Mclccular and Cellular Proteomics 2002 年 12 月号发表的一篇论文称， 人

9、血清中已确证的餐白种类几乎翻了一番，即达到49（）种。这是Pacific Northwest National Laboraton- （PNNL）的科学家利用液相层析法和质谱分析法代替传统凝胶 电泳法鉴定的成果。这些人血清罢白包括了先前在血清中耒鉴定出来的低丰度页 白，以及尚耒明功能的页白。由于方法的限制，我们所用的传统电泳方法根本不 可能完全分离。5.2血清中的罢白主要是由白岳白与球页白所构成。健康人的白岳白与球页白的 比例为白番白约67%,球孫白约33%。所以图1右中条带较深的页白质（C）应 该为球番白，图1左中被检测的条带（CJ恰好是这条较深的条带，说明被检测的 餐白就是免疫球番白G （

10、IgG）o这样图1左的免疫反应结果也得到合理的解释， 但是决定性的结论应从两种番白在SDS-PAGE电泳中的迁移率进行分析，但是尚 来得到此方面的资料。5.3本实验所用的免疫印迹方法称晦联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）,其方法简单，方便迅速，特异性强。ELISA是由抗原（抗体）先结 合在冏相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的 偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与晦活性，当偶联物与冏相载体 上的抗原（抗体）反应后，再加上晦的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应 而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测

11、的抗原（抗体）含量成正比。并且抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出 现可见反应。5.4 IgG即免疫球罢白G,与104和IgA属三种同种型天然肖身抗体。晦标记抗 体IgG是将诲与抗】gG抗体经适当方法连接而成。由于辣根过氧化物诲（Horseradish Peroxidase, HRP）活性高,稳定，分子量小,纯晦容易制备，所以最常用。HRP的 催化反应需要底物过氧化氧但2（为和供氢体（DHJ。本实验所用的供氢体DAB（3.3 二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫晦 染色。由于HRP的底物巴。2本身又是酶的抑制剂,因此晦促反应中使用的比。2 不能过