《生物化学》-核酸测序技术的发展历程

1、装 订 处南开大学现代远程教育学院考试卷 2019年度秋季学期期末(2020.2) 生物化学主讲教师： 李登文一 、请同学们在下列（10）题目中任选一题，写成期末论文。1、蛋白质的结构与功能关系2、酶高效降低活化能的内在因素和作用3、核酸测序技术的发展历程4、导致维生素缺乏的原因和应对策略5、胆固醇在人体内的好与坏6、喝咖啡的减肥作用7、人体维持血糖水平稳定的策略8、海洋表面泄露石油的消解9、葡萄糖-丙氨酸循环对氨转运的经济有效性10、糖、脂、氨基酸与核苷酸代谢的相互联系二、论文写作要求论文题目应为授课教师指定题目，论文要层次清晰、论点清楚、论据准确；论文写作要理论联系实际，同学们应结合课堂讲

2、授内容，广泛收集与论文有关资料，参考一定文献资料。 三、论文写作格式要求：论文题目要求为宋体三号字，加粗居中；正文部分要求为宋体小四号字，标题加粗，行间距为1.5倍行距；论文字数要控制在20002500字；论文标题书写顺序依次为一、（一）、1. 。四、论文提交注意事项：1、论文一律以此文件为封面，写明学习中心、专业、姓名、学号等信息。论文保存为word文件，以“课程名+学号+姓名”命名。2、论文一律采用线上提交方式，在学院规定时间内上传到教学教务平台，逾期平台关闭，将不接受补交。3、不接受纸质论文。4、如有抄袭雷同现象，将按学院规定严肃处理。核酸测序技术的发展历程DNA测序技术，即测定DNA序

3、列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。人类基因组这部由A、T、G、C四个字母组成的卷帙浩繁的生命天书如同一座宝库，保藏着几千年来人们迫切想知道的秘密，DNA测序技术就好似&qu

4、ot;芝麻开门"这样的咒语，是我们打开宝库的金钥匙世界上第一个测定DNA序列的方法是由英国生化学家弗雷德里克·桑格尔发明的。自此DNA测序的速度就一直呈加速态势。2001年人类基因组草图耗资4.37亿美元，耗时13年。到了2007年，第一个完整人类基因组序列图谱的诞生只花费了150万美元，3个月就搞定。2009年1月2日，美国加州太平洋生物科学公司的科学家乔纳斯·考尔拉赫、斯蒂芬·特纳及其研究小组在科学杂志上发表论文称，他们将纳米技术与芯片技术相结合，发明了一种新型测序方法，速度是现有技术的3万倍。Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸

5、结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。Promega公司的SI

6、LVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。Taq DNA聚合酶在95时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq

7、DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。

8、则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95变性、70退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处:(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除

9、由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点:(1) DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。(2) 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混

10、杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。 DNA测序仪(3) DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4备用。2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂:(1) 样品反应:质粒模板DNA 2.

11、1pmol5×测序缓冲液 5ml引物 4.5pmol无菌ddH2O 至终体积16ml(2)对照反应pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml5×测序缓冲液 5mlpUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml无菌ddH2 O 至终体积 16 ml3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。6. 把反应管放入预热至95的

12、热循环仪，以注意中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3l DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。注意 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入:模板种类/长度 模板量200bp (PCR产物) 16ng(120fmol)3000-5000bp(超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)48000bp(,粘粒DNA) 1mg(31fmol)由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式:4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式:dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95。温度变换应越快越好