XXXX年现代微生物发酵复习资料(修订版)

1、现代微生物发酵及技术教程复习资料发酵 :利用微生物进行生长和代谢活动，并通过为现代化工技术，进行微生物代谢活动形成各种有用产品的过程，包括有氧和无氧的发酵。微生物发酵的特点发酵的催化作用都在细胞内进行；比表面积很大（表面积/ 体积）；原料来源广，价格低廉；反应条件温和生产过程安全；设备“多能化”，代谢途径多样化；具有易变异性。发酵简史列文虎克发明了显微镜，算是微生物的发现者吧。巴斯德，贡献是彻底否定了自然发生学说，对免疫学的研究，首次制成狂犬疫苗，进行预防接种，正是发酵由微生物引起，创立巴氏消毒法。科赫，细菌学奠基人， 贡献是正是炭疽病菌是炭疽病的病原菌，发现肺结核病的病原菌，提出了科赫法则，

2、创立了分离纯化微生物的技术。应用 ：食品工业；医药保健食品工业；减缓资源能源衰竭；深入广泛的改善环境；农牧业增产诱变育种 :就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。紫外诱变的步骤：诱变处理将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0.5-1min。 4.取0.1-0.2mL诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37暗箱培养48h。紫外线诱变，一般采用15W或 30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min

3、 ，死亡率控制在50 -80 为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，细胞浓度要适宜，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。光修复可见光能够激活某些光复活酶，将照后受损的DNA 部分进行修复，因此称之为光修复或光复活作用。光复活酶能识别嘧啶二聚体，并利用光所提供的能量使二聚体环打开而完成修复。（另外， 低剂量紫外线诱变遭到可见光照射突变效应和致死作用均下降，而高剂量时发生致死作用的回复而突变效应不变）原生质体融合通过人为方法使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。包括以

4、下过程：将遗传性状稳定，带有不同遗传标记（一般为营养缺陷型和抗药性等） 且具有互补优势的两个亲本通过酶（根据处理细胞壁组成的不同进行选择，细菌放线菌溶菌酶，放线菌还可用裂解酶2 号、消色肽酶，酵母菌和霉菌蜗牛酶、壳多糖酶、 纤维素酶、半纤维素酶）解脱壁形成原生质体，一般使用聚乙二醇助融等量的原生质体（助融分为：生物仙台病毒，物理离心、电脉冲，化学PEG+），原生质体再生即融合的原生质体重新形成细胞壁，最后检出并鉴定融合子。退化 ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。是细胞群体中退化细胞从量变到质变的逐步演变的过程（在形态上的包子减少

5、或颜色改变）复壮： 狭义的复壮：是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。广义的复壮：是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。（答题只用广义）菌种保藏的原理目的方法原理：人为创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活跃生长繁殖受抑制的休眠状态，尽可能减少其变异率，主要是低温、干燥、缺氧、营养缺乏等四方面的条件目的： 1，使菌种不至于死亡绝种，不污染杂菌；2，使菌种保持优良的性状、高存活率、低变异率

6、，以利于生产研究交换使用。方法：斜面保藏、液体石蜡保藏、载体保藏、悬液保藏、冷冻干燥保藏、寄主保藏乳糖操纵子： 乳糖操纵子在缺乏乳糖等诱导物时，由调节基因( lac I) 编码的调节蛋白（即lac 阻遏物）一直结合在操纵基因上，抑制着结构基因转录的进行。当细胞中有诱导物存在时，乳糖与阻遏蛋白相结合，使阻遏蛋白发生构象变化，结果降低了阻遏蛋白与操纵基因间的亲和力，使它不能继续结合在操纵子上，操纵子的“开关”被打开，结构基因的转录、翻译可顺利进行。使吸收和分解乳糖的酶诱导产生。当诱导物耗尽后，阻遏蛋白可再次与操纵基因结合，这时转录的“开关”又被关闭，酶就无法合成巴斯德效应： 由于葡萄糖在有氧呼吸中

7、获得的能量比无氧呼吸和发酵时获得的多得多，所以兼性厌氧微生物在有氧条件下，终止厌氧发酵而转向有氧呼吸，这种呼吸抑制发酵的现象称之为巴斯德效应，其本质是能和与代谢调节的结果。所以酒精发酵的供氧条件：无氧（非重点）谷氨酸产生菌大多数的生理特性：生物素缺陷型，-酮戊二酸氧化能力弱，L-谷氨酸脱氢酶活性强，NADPH2 再氧化能力欠缺，细胞膜通透性改变。谷氨酸产生菌发酵过程中生物素控制亚适量的原因： 1，使得产生菌代谢失调，进行不完整TCA，在 NH4+ 存在下， L-谷氨酸脱氢酶活性强，NADPH2 再氧化能力弱，异柠檬酸裂解活力低， DCA循环支路封闭，转化为谷氨酸生产型；2，改变细胞膜的渗透性，

8、使得谷氨酸不断分泌出细胞外除去谷氨酸积累所引起的反馈调节3. 亚适量时促进 - 酮戊二酸合成、浓度过大：促进菌体生长，耗糖快，谷氨酸产量低。浓度过少，菌体生长缓慢，耗糖慢快，发酵周期长，谷氨酸产量低。谷氨酸的发酵条件：1、菌体生长期生长素应该足量，产酸期生长素亚适量；2、发酵前期低通风量，发酵中、后期高通风量；3、 NH4+ 以连续流加的方式添加，碳氮比 100 ： 11 时开始积累谷氨酸，100 ： 21 时大量积累，在菌体生长期碳氮比较高；4、具体生长期温度 3032 ，产酸期3437 ； 5、 pH 应该保持偏碱性，前期7.58.0 ，中后期7.07.66、 发酵采用透光率在90以上的水

9、解糖，接种量 为 2 -5 （加粗的比答）抗生素发酵调控中添加磷酸盐的目的： 1、抑制次级代谢产物前体的合成；2、抑制和足额次级代谢产物合成中关键酶的活性和合成；3、导致细胞能荷的改变前体 ：指微生物在代谢过程中其中某一代谢中间体的前一阶段的物质（这是个小题，看看就可以）发酵工程 是利用微生物细胞的代谢过程生产有用的各种产物的过程，有三个核心部分：1、菌种的选育2、为菌种提供适宜条件，充分发挥菌种生产能力；3 提取分离纯化发酵产物，提高产品质量。其中菌种是基础，发酵是关键，分离纯化是保障。微生物工程致力于研究和解决整个过程的工艺设备问题，将实验室和中试成果扩大大工业化生产。淀粉的糊化 ：淀粉在

10、高温下溶胀、分裂形成均匀糊状溶液的特性淀粉的老化： 分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶过程。淀粉的液化 ：在 - 淀粉酶作用下淀粉的可溶性增加，淀粉乳黏度急剧下降形成糊精及低聚糖的过程淀粉的糖化：利用糖化酶进一步将糊精及低聚糖转化为葡萄糖的过程连续灭菌（连消）：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时对培养及进行加热保湿冷却而实现灭菌，其灭菌温度126132 总蒸汽压 0.140.MPa为宜实罐灭菌（间歇灭菌）：配制好的培养基放置于发酵罐或其他装置，通入蒸气将培养基和设备一起加热，达到预期灭菌温度后维持一段时间，再冷却到发酵温度的湿热灭菌过程发酵阶段碳氮

11、比的控制：一般来说菌体生长期，氮源要多一些，发酵阶段，碳源要多一些，而且应该适时补料，例如谷氨酸发酵时4:1 的碳氮比（ 2%葡萄糖，0.5% 尿素）菌体大量繁殖， 3:1时谷氨酸大量积累。另外，微生物利用营养物质有三方面作用：构成菌体，形成各种代谢产物，提供能量。下游加工特点 ： 1 、发酵液是复杂的多相系统，固液分离困难（系统多相性）； 2、目的产物含量低而对纯度要求高且不稳定，故要求温和的且有较高收率的分离纯化操作（产物不稳定性） ；3、发酵液含有与目的产物理化性质相近的杂质，增加分离纯化难度（杂质分离复杂）； 4、为适应复杂的发酵工程要有相适应的下游加工工艺已保证产品的纯度和质量（工艺

12、适应性）发酵液实验室常用的固液分离方法：过滤、离心、膜分离、双水相萃取、扩张吸附细胞破碎方法：物理（高速匀浆、挤压、高速珠磨、超声破碎）化学（渗透冲击、增溶）生物（酶溶常用酶溶菌酶、蛋白酶、 -1,3- 葡聚糖酶等另P118 页）盐析 ：在高浓度中性盐存在下，是生物分子在水溶液中的溶解度降低而产生沉淀盐溶 ：将中性盐加入蛋白质溶液中，开始蛋白质溶解度随盐浓度增加而增加盐析的机理及影响盐析的因素机理 ：与蛋白质竞争水分子降低用于溶解蛋白质的有效水量减弱蛋白质的水合度，破坏蛋白质的水化膜降低其溶解度；中和蛋白质电性，减弱蛋白质之间排斥，降低溶解度；引起原本在蛋白质周围有序排列的水分子的极化，降低水

13、的活度。影响盐析的主要因素1）蛋白质浓度高浓度 pr 溶液，可减少盐的用量；但共沉严重;低浓度 pr 溶液，需用较多的盐，共沉作用较轻。2）离子强度和种类高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的:离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，离子半径较大而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是对Ks 值的影响， Ks值越大，该盐的盐析效果越好。3）温度温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小,这主要是因

14、为蛋白质分子失水时则放热；温度升高有利于蛋白质失水沉淀。4）pH 盐析pH 的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH 作为盐析pH萃取 ：利用不同物质在选定溶剂中溶解度不同来分离混合物中组分的方法萃取影响条件： pH、温度、盐析作用、溶剂性质带溶剂 ：与目的产物形成复合物而易溶于溶剂并可在一定条件下分解得到目的产物的物质乳化 ：萃取过程中一相分散在另一相中形成乳浊液的现象去乳试剂：十二烷基磺酸钠（SDS）和溴代烷基吡啶常用双水相萃取系统：高聚物 / 高聚物（ PEG/葡聚糖）； 高聚物 / 无机盐（ PEG/硫酸盐）双水相萃取影响条件：成相聚合物的相

15、随分子质量，成相聚合物的浓度，盐的种类和浓度， pH ，温度结晶 ：物质从液态或气态形成晶体的过程，是制备高纯度固体物质特别是小分子物质的重要方法结晶的过程：饱和溶液的形成，晶核形成，晶体的生长（溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。）结晶的方法 ：冷却结晶、浓缩结晶、化学反应结晶、盐析结晶饱和溶液 ：溶液中溶质的浓度为溶质溶解度时的溶液过饱和溶液 ：溶质浓度超过其溶解的的溶液固定化酶（细胞）：将水溶性的酶（或整个细胞）用水不溶性的载体媳妇交联或包埋起来，这种酶(或细胞 )称水不溶酶（或细胞）或固定化酶（细胞）固定化酶的方法：吸附（物理吸附、离子吸附）、交联、包埋（凝胶包埋、

16、半透膜包埋、纤维包埋）、共价键结合（重氮法、溴化氰法）吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。固定化细胞的制备方法：1. 不用载体的细胞固定用适当的方法处理不加载体直接使用或加絮凝剂与添加剂共同成型。将细胞在适当的温度下处理使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。2 包埋法 ：琼脂凝胶包埋法海藻酸钠凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法固定化细胞的特性及优缺点：特点：活力低于游离细胞(醋酸杆菌例外)，最适温度一般于游离细胞差不多，稳定性优于游离细胞半衰期高于游离细胞，最适pH 因载体不同而有差异（带负电载体较游离的细胞高，带正电的则低，而不带电的则相差不大）优点 ：1.使用固定化细胞

17、省去了酶的分离过程，显著降低了成本。2.适合于进行多酶序列反应 3.可重复使用， 4.操作简单，单批发酵的细胞一次即将细胞排弃，节约用于细胞生长的养料 5. 增加了细胞对不利环境的耐逆性，增加了酶的稳定性，应用范围广；缺点 ：1. 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。2.多酶系统易产生副产物3 细胞壁和细胞膜造成底物渗透和扩散障碍 .谷氨酸产生菌为细胞缺陷型在发酵过程中添加青霉素的原因：青霉素结构类似于肽聚糖末端结构，作用在细胞壁上，干扰细胞壁的合成，造成细胞壁不完全，使得细胞膜处于不完全保护，又由于膜内外渗透压差导致细胞膜损伤增大了谷氨酸的通透性，促进谷氨酸排出细胞。关键：必须在增殖过

18、程的适当时期添加，且必须在添加后再进行一定的增殖。谷氨酸分离提取的常用方法： 1.等电点法、 2 离子交换法、 3 等电点 -离子交换法、抗生素按机制分类：一、影响细胞壁合成 ：青霉素、 头孢菌素二、 影响核酸合成 ：例如利福霉素、博莱霉素等。 三、 影响蛋白质合成 氨基糖苷类、四环素类和氯霉素。四、影响细胞膜通透性：多粘菌素青霉素的抗菌机制、抗菌谱及稳定性：抑制细菌转肽酶、阻止细胞壁肽合成中的交叉连接步骤是正处于繁殖期的细胞壁的合成发生障碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞因渗透压等原因发生自溶而死亡。作用于大多数革兰氏阳性菌及部分阴性菌，是窄谱抗菌素。酸性物质，游离状态不如其碱金属盐稳定，干燥纯

19、净的青霉素盐稳定，在溶媒中较稳定，青霉素低温下稳定。青霉素在偏酸环境（pH57 ）中稳定， pH6 最稳定，吸湿降解。青霉素萃取的目的原理及影响因素：目的 ：因为青霉素滤液中纯度很差，杂质多，颜色很深，不具备药用价值只有进行萃取才能为精制工艺提供合格原料，生产出符合要用标准的青霉素。原理 ：青霉素在水中溶解度小易溶于有机溶剂，其钠盐钾盐易溶于水，不溶或难溶于有机溶剂。（故将滤液加稀硫酸醋酸丁酯使其以酸的形式萃取如醋酸丁酯之后将碳酸钾加入醋酸丁酯实现反萃取）影响因素：pH 、温度、乳化现象、工艺过程及浓缩倍数、微生物污染、萃取时间、混合效果。青霉素为什么支撑盐而不青霉素粉的原因： 1.碱金属盐稳

20、定性较游离酸形式好2、青霉素在水中稳定性差易水解，因而不宜做成水针剂存放，只能做成晶体形态才能长期保存合成阶段， 苯乙酸或苯乙酰胺可用作为青霉素发酵的前体 。青霉素发酵的最适温度一般认为在25左右。前期控制25 26左右，后期降温控制23。青霉素合成的适宜pH6.46.6 左右，避免超过7.0，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解。前期pH 控制在5.7-6.3，中后期 pH 控制 6.3-6.6通气比一般为 1：0.95。溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥定义优点缺点在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物操作简单， 周期短， 染分批发酵菌种进

21、行培养，在特定菌机会少， 生产过程和产率低的条件下只完成一个生产品质量容易掌握长周期的微生物培养方法微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断控制稀释速率可以使长期连续培养会引起添加新鲜的培养基，同连续发酵发酵过程最优化。发酵菌种退化，降低产量。时不断放出代谢物，使周期长，产量高染菌机会增加微生物细胞在近似恒定状态下生长的培养方式与连续培养相比(1) 降低了染菌， 避免了遗传不稳定性。(2) 最终产根据菌体生长和初始培物浓度较高，有利于产(1)由于没有物料取养基的特点，在分批培物的分离。(3) 使用范出，产物的积累最终导分批补料发酵养的某些阶段适当补加围广 与分批培养相比致比生产速率的下降。培养基，使菌体或其代(1) 解除底物抑制和葡(2) 由于物料的加入增谢产物的生产时间延长萄糖的分解阻遏效应。加了染菌机会(2) 延长次级代谢产物的生产时间。（重点）淀粉水解糖的方法定义要求/缺点优点以酸为催化剂，在高温高酸解法（酸糖耐酸、耐高温、生产方便、 设备简单、 水解压下将淀粉水耐高压的设备时间短设备生产能力大化法）解成葡萄糖的方法转移性很强的设备多，酶本身温和，专一性强， 可水解高淀粉酶及糖化是蛋白质，易引酶解法（双酶浓度淀