3500基因测序仪操作流程

1、3500基因测序仪操作流程一、启动仪器1 .按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。2 .打开与仪器连接的计算机，点击 Ctrl+Alt+Delete界面，点击 Administrator, 输入密码：Administratoro等待Daemon （隐藏图标），Server Monitor程序完全 启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。3 .打开3500 Data Collection软件，出现 3500 Log In登录界面，输入用户名和 密码，本机用户名为：Administrator,密码为：Administrator1 ,点击“ OK”，打

2、开软件。检查所有耗材的剩余用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护 提示灯信息。4 .确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至 室温0注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP 胶在仪器上存放一周后需置于2-8C保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。5 .将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh,确认所有耗材均为有效状态。二、仪器维护1 .于软件主界面点击 Dashbord,于菜单栏中选择 Maintenance Wizards选项。2 .将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择

3、WASH pumper chamber and chanel选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给 毛细管灌胶直至完成全部操作。3 .从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。结果应满足如 卜要求：峰高大致相同（大于 6000）;峰型尖锐，左右堆成；橙色十字在峰顶端；峰间距为13-16。当结果满足要求时，选择“ Accept Results'，否则， 选择“Reject Results'，重新进行空间定位。4 .从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。本仪器为8道毛细管，光谱校准品加样的位置为 A1-H1 ,校准

4、结果允许借用周边1道毛细管的 结果；光谱校准通过显示绿色，借用信息为黄色箭头，失败为红色。校准成功选 择“Accept"，否则，选择“ Reject”，重新进行光谱校准。三、检测运行1.测序PCR（以BigDye Terminator v3.1试剂盒为例），标准质粒和样品推荐测序 反应体系及反应条件如下：标准质粒测序反应体系：引物4 n L Big dye 1仙L, BigDye Seq Buffer 3.5仙L 超纯水10.5模板1样品测序反应体系：引物（10 pM） 0.5 n L, Big dye 1小乙BigDye Seq Buffer3.5 nL,超ZfcK 14 nL 模

5、板 1 nLo测序反应条件为：96 C 1 min f（96 C 10 sec - 50 C 5 sec - 60 C4 min） x 25个循环f4 C保温2 .测序产物纯化（以CENTRI-SEP spin-columns纯化柱为例介绍） 于纯化柱中加入800 n L的无RNase超纯水，颠倒混匀，室温静置 30 min。上下颠倒除尽气泡，去掉纯化柱底部的盖子，置于 2 mL洗脱管中，在将纯 化柱上部的盖子打开后，盖上盖子，压入空气，柱中的液体自动流入洗脱管中直 至自行终止，最后洗脱管中的液体大约为 200-250 nL弃掉滤液。750Xg离心2 min去除多余液体，离心完毕后洗脱管中约有

6、300仙L液体。 将纯化柱转移至1.5 mL的样品收集管中，从柱的斜面上缓缓加入 20的PCR测序产物。750电离心2 min,取滤液备用，静止重复离心。3 .测序产物加样 于待检测孔中加入10的Hi-Di甲酰胺后，再次加入10纯化后测序产 物，混匀，尽量避免气泡产生，不加样的空中加入10的超纯水。 于96孔板上安装胶垫，按照顺序组装到自动进样器上。4 .数据收集软件运行点击 Start pre-heatS热 30 min, POP7和 POP4的胶预热至U 60 C, POP6的胶 预热到50 C,预热后检查detection cell的温度。通过Main workflow 键进入Set u

7、p视窗，选择 De巾ne Plate Properties#面建立新的样品反应板，在 Name栏输入样品板的名称，板子类型：96孔板，毛细管 长度：50 cm,胶以及测序类型根据需要选定。输入样本名称，选择相应的Assays, File Name Conventions, Results Groups切换到Load Plates for Run视图，从Recent Plates找到要电泳的反应板，点击Link Plate （灰色表示反应板连接上，黑色则表示没有连接上），点击Start Run 进行电泳。切换到 Monitor Run视图，通过 Assay, Sample, EPT界面查看样品的

8、电泳 情况；通过Flags Found界面借助软件可直接判断样品的结果是否满足质量要求， 红色旗帜表示不满足质量要求，绿色旗帜表示满足质量要求。 进入Review Results视窗，点击 View Fragment/HID Results查看样品的电泳 结果。如Offscale （峰过高，导致渗透峰产生），Board Peak （宽峰）等要素的图 标为绿色方块，Sizing Quality (内标的质量)为带对号的绿色方块，则表示满 足质量要求；如 Offscale, Board Peak的图标为黄色三角形，Sizing Quality为带 X的红色方块，则表示不满足质量要求，可以通过Plo

9、t View和Sizing Table View 等界面分别查看样品的电泳图谱和内标的情况。5 .测序结果分析 点击sequence analysis V5.软件，输入用户名DangDongCIQ,输入密码123456, 打开软件。点击File,选择Add sample,选择所需分析测序文件。点击绿色三角形图标进行测序结果分析。测序峰图的荧光信号强度正常范围为1000-3000,且峰间距明显，测序结果质量分数较高，可视为本次测序基本成功。6 .常见问题及解决措施(1)信号值太高样品浓度过高，应稀释样本浓度，降低进样时间。反应体系中DNA加入过量。(2)无信号值测序反应失败。毛细管堵塞，重新灌胶。毛细管阵列弯曲，应重新更换毛细管阵列。毛细管破裂或损坏(3)低信号值甲酰胺降解，更换新的Hi-Di甲酰胺。样本量不足，增加DNA的量样本中盐浓度过高，采用蒸储水或去离子水对样本进行稀释或采用去盐的纯化 柱继续样本纯化。测序样本未充分混匀。DNA扩增效率低，重新扩增 DNA或检查DNA质量。自动进样器超出校准范围。检查样本体积，如果信号任然很低，联系 ABI技 术顾问。(4)过高的基线管路中的胶可能存在污染，可采用 conditional reagent清洗胶泵。胶中可能存在污染