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文档简介

1、DNAM序仪的原理原理：（一）双脱氧链末端终止法测序原理（二）新生链的荧光标记原理（三）荧光标记DNA勺检测原理（一）、Sanger等人：双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂一类似于正常dNTP的2' ,3'-双脱氧核甘三磷酸（ddNTP）,将延伸的DNAJ特异性地终止。 其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分 四组，每组按一定比例加入一种（ddNTP）,它能随机渗入合成的 DNA 链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核甘酸必定 为该种核甘酸，可以从放射自显影带上直接阅读 DNA勺核甘酸序列。与dNTP相比，ddNTP在脱

2、氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应 过程中虽然可以在DNAt合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的 DNA链的末端月氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到 DNA 链中，但它们本身没有-OH,不能同后续的dNTP1成磷酸二酯键，从 而使正在延伸的DNAJ在此终止。据此原理分别设计四个反应体系， 每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种 dNTP和一种ddNTP侧ddATP）,则新合成的DNAJ在可能掺入正常dNTP的位置者B 有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在 ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核昔酸片段（二）、新生链的荧光标记原

3、理多色荧光标记法-荧光标记引物法定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用 引物的5'端一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不 同。多色荧光标记法-荧光标记终止底物法4种ddNT吩别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团 的ddNT而掺入DN时段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了 一种特定的荧光染料根据荧光颜色的不同来判断所代表 的不同碱基信息。（三）、荧光标记DNA勺检测原理测序反应一般以单引物进行DN麋合酶延伸反应，绝大多数产物均 为单链反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开 始电泳两极间极高的电势差推动着各个荧光 DN砧段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光 DNA段DN的段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长

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