第三章 层析技术

1、第三章第三章 层析技术层析技术Chromatography作作 者：王者：王 英英联系电话联系电话、概一、概 述述 层层析析（Chromatography）又称为又称为色色谱谱, ,它利用它利用混合物混合物中中各组分各组分的的物理、化物理、化学性质学性质间的间的差异差异( (溶解度、分子极性、溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附力、分子亲分子大小、分子形状、吸附力、分子亲和力等和力等) ) ，使，使各组分各组分在在支持物支持物上集中上集中分分布在不同区域布在不同区域，借此，借此将各组分分离将各组分分离。 1、分配系数、分配系数(Partition chromat

2、ography) 混合物混合物在在层析层析过程中不管层析技术采过程中不管层析技术采用的用的流动相流动相和和固定相固定相是哪种状态都要达到是哪种状态都要达到分配平衡分配平衡。叙述一种物质在两种特定的相。叙述一种物质在两种特定的相中的分配程度用中的分配程度用分配系数分配系数（K）来表示。在）来表示。在特定温度特定温度时这个系数是一个时这个系数是一个常数常数。溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度Cs K= = 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 Cm 从一个混合物中从一个混合物中分离分离、纯化样品的纯、纯化样品的纯度如何，取决于混合物中各组分度如何，取决于混合物中各组分K值的差异值的差异程

3、度。程度。 混合物混合物中各组分若中各组分若 K值相差较大值相差较大, 则则较较易易把混合物中的各把混合物中的各样品样品分离分离。反之。反之,K值相值相差较小差较小,则则不易分离不易分离。 2、塔板理论塔板理论 在层析在层析分析过程分析过程把把层析柱层析柱划分划分(想象想象)为为若干个若干个连续部分连续部分,每个部分称为一个每个部分称为一个塔板塔板。 理论板数理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断断加入，化合物在流动相和固定相中不断分分配平衡配平衡，所发生的，所发生的平衡次数平衡次数称为称为理论板理论板数数。色谱历史色谱历史古罗马人分

4、析混合染料（类似辐射纸色谱）古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）1903年，年，Michael Tswett提出色谱法提出色谱法1931年，年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素采用柱色谱分离了类胡萝卜素1941年，年，Martin和和Synge提出分配色谱法提出分配色谱法 1944年，年，Martin等又提出纸色谱法等又提出纸色谱法 1952年，年，Martin和和James发明了气液色谱法发明了气液色谱法1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立代色谱分析的建立1956年，年，Stahl系统研究了薄层色谱法系统研究了薄层色谱法(TLC

5、)1958年，年，Stein和和Moore研制出氨基酸分析仪，研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构确定了核糖核酸的分子结构1967年，年，Horvvath和和Huber等研制了高效液等研制了高效液相 色 谱相 色 谱 ( h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography,HPLC)仪仪1975年，年，Small等提出离子色谱等提出离子色谱 20世纪世纪80年代，超临界色谱年代，超临界色谱20世纪世纪90年代，毛细管电泳（年代，毛细管电泳（1809年年Ress第一次电泳实验）第一次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱

6、分离、制备世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展色谱可望取得更大的发展 层析法层析法进行时有进行时有两个相两个相组成，一组成，一个为个为固定相固定相(Stationary phase )，另一个，另一个为为流动相流动相(Mobile phase )。由于。由于各组分各组分所受的在所受的在固定相的阻力固定相的阻力和和流动相的推流动相的推力力影响影响不同不同，各组分，各组分移动速度移动速度也也各异各异，从而从而使各组分得到分离使各组分得到分离。二、层析的一般原理二、层析的一般原理三、层析技术的分类三、层析技术的分类 ( (一一) )按两相所处的按两相所处的物态物态分类分类 以以

7、液体液体作为作为流动相流动相的称为的称为液相层析液相层析 以以气体气体作为作为流动相流动相的称为的称为气相层析气相层析 其其固定相固定相也可有也可有两种状态两种状态: 以以固体固体作为作为吸附剂吸附剂的固定相的固定相 以以涂布涂布在在固体表面固体表面的的液体液体作为固定相作为固定相（二）按固定相形式分类（二）按固定相形式分类 1、柱层析、柱层析（colum chromatography） 将固定相装在层析柱中将固定相装在层析柱中 2、纸层析纸层析（paper chrmatography） 纸作为固定相纸作为固定相 3、薄层层析薄层层析（thinlayperchromatography） 将吸附

8、剂在玻璃板或其他材料薄板上铺成将吸附剂在玻璃板或其他材料薄板上铺成薄层作为固定相薄层作为固定相（三）按层析过程的机制可分类（三）按层析过程的机制可分类 1、吸附层析、吸附层析(adsorption chromatography ) 利用不同组分利用不同组分吸附能力吸附能力的不同进行分离的不同进行分离 2、分配层析、分配层析(partition chromatography ) 利用不同组利用不同组分配系数分配系数不同进行分离不同进行分离 3、离子交换层析、离子交换层析（ion-exchange chromatography ） 利用离子交换剂与各组分之间的利用离子交换剂与各组分之间的静电力静电

9、力不同不同 4、凝胶层析、凝胶层析（gel chromatography） 利用不同组分之间利用不同组分之间分子大小分子大小不同进行分离不同进行分离 5、亲和层析、亲和层析（affinity chromatography） 利用生物大分子之间利用生物大分子之间特有亲和力特有亲和力的不同进行分离的不同进行分离 第一节第一节 凝凝 胶胶 层层 析析 Gel Chromatography一、概一、概 念：念： 凝胶层析凝胶层析：按照被分离：按照被分离物质分子大小物质分子大小,经经过具有一定孔径的过具有一定孔径的多孔凝胶物质多孔凝胶物质进行分离的进行分离的一种方法。又称为一种方法。又称为凝胶过滤凝胶过

10、滤或或分子筛过滤分子筛过滤或或排阻层析排阻层析。 主要机理是主要机理是分子筛效应分子筛效应,当被分离当被分离物质物质流流经经凝胶柱凝胶柱时时,因各组份的因各组份的分子大小不同分子大小不同,在凝胶在凝胶受到的受到的阻滞阻滞作用作用有差异有差异,从而造成各组分在从而造成各组分在凝凝胶柱胶柱中的中的迁移速度不同迁移速度不同得到分离。得到分离。 将将样品样品加入凝胶柱后加入凝胶柱后,分子大分子大的组份的组份不能不能进入凝胶中进入凝胶中被排阻在外被排阻在外,而而分子的小能通过孔分子的小能通过孔隙进入凝胶中隙进入凝胶中。加入。加入洗脱剂洗脱剂后后,大分子大分子就随洗就随洗脱剂从脱剂从凝胶颗粒间隙凝胶颗粒间

11、隙洗脱下来洗脱下来,其其流程短流速流程短流速快快,而而小分子小分子物质从物质从上一层凝胶孔隙中出来又上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复这样多次反复即即流流程长程长,故大分子物质先从柱中流出故大分子物质先从柱中流出,小分子物质小分子物质后流出而得到分离。后流出而得到分离。二、基本原理二、基本原理 大分子大分子不能进不能进入凝胶孔隙中入凝胶孔隙中,被排被排阻在外阻在外,受到受到阻力小阻力小,流程短流程短，流速快流速快，先先从柱中流出。从柱中流出。 小分子小分子进入凝进入凝胶孔隙中胶孔隙中,阻力大阻力大，流程长流程长，流速慢流速慢，后后从中柱流出从中柱流

12、出 。 三、凝胶层析的数理关系三、凝胶层析的数理关系 1、柱床体积、柱床体积(VT) ：即凝胶颗粒的体积以：即凝胶颗粒的体积以及外部间隙体积的总和。及外部间隙体积的总和。 2、洗脱体积（、洗脱体积（Ve）：即欲分离物质被洗脱：即欲分离物质被洗脱下来所需的洗脱液的体积。下来所需的洗脱液的体积。 3、外水体积（、外水体积（V0）：即凝胶颗粒间隙水的：即凝胶颗粒间隙水的体积，相应于流动相的体积。体积，相应于流动相的体积。 4、 内水体积（内水体积（）：即凝胶颗粒内所含）：即凝胶颗粒内所含水的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量水的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。求得。 5、凝胶颗粒干体积（

13、、凝胶颗粒干体积（）+ 洗脱体积（）与及之间的关系洗脱体积（）与及之间的关系 （）（） 为分子量不同的样品组分在凝胶为分子量不同的样品组分在凝胶内部和外部两相间的分配系数。内部和外部两相间的分配系数。 它与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒它与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关，而与柱的长短粗细等物孔隙的大小有关，而与柱的长短粗细等物理条件无关。理条件无关。 Kd = 0时时,Ve = Vo,意味着该分子完全意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外被排阻于凝胶颗粒之外,在固定相分布为在固定相分布为0,全部分布于流动相里而最先流出。全部分布于流动相里而最先流出。 当当Kd = 1时时,Ve =

14、 Vo + Vi,意味着该分子意味着该分子完全不被排阻完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相它能均等地分布在流动相和固定相里里,在两相分配的比值为在两相分配的比值为1,而最后流出而最后流出. 当当0 Kd 4条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 。 3、离子交换凝胶：、离子交换凝胶： 分离大分子物质分离大分子物质 葡聚糖（葡聚糖（Sephadex） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAG） 琼脂糖（琼脂糖（Sepharose）三、操作注意点三、操作注意点（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择 原则：根据被分离物质的性质选择

15、对原则：根据被分离物质的性质选择对被分离物质各组分之间结合力差异大的交被分离物质各组分之间结合力差异大的交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。比较满意的结果。考虑因素：考虑因素：1.被分离物质带何种电荷。被分离物质带何种电荷。2.被分离物质分子的大小，大分子物质选用被分离物质分子的大小，大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素。凝胶，其次选用纤维素。3.被分离物质所处的环境。被分离物质所处的环境。4.被分离物质的物理化学性质。被分离物质的物理化学性质。5.被分离物质的大概数量。被分离物质的大概数量。 根据分离过程的实验条件根据分离过程的实验条件 ：

16、 强酸强碱：强酸强碱： 应用广泛应用广泛 弱弱 酸酸 型：只能在碱性型：只能在碱性pH范围内使用范围内使用 弱弱 碱碱 型：只能在酸性型：只能在酸性pH范围内使用范围内使用 (三三) 洗脱剂洗脱剂 原则：所用洗脱液比样品具有更活泼原则：所用洗脱液比样品具有更活泼的离子或基团。的离子或基团。 改变改变pH或离子强度或离子强度 ：降低被分离物降低被分离物与离子交换剂的结合力。与离子交换剂的结合力。 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱（二）（二）缓冲液的选择缓冲液的选择 原则：不能发生化学反应，所带电荷原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致，避免使样品变性应与样品一致，避免使样品变性四、应用

17、四、应用 分离蛋白质、多肽、氨基酸、分离蛋白质、多肽、氨基酸、核酸及其他小分子带电的物质核酸及其他小分子带电的物质第三节第三节 亲亲 和和 层层 析析Affinity Chromatography一、概念：一、概念： 亲和层析是利用生物大分子之间亲和层析是利用生物大分子之间特有的专一亲和力而达到分离纯化的特有的专一亲和力而达到分离纯化的层析方法。层析方法。二、亲和层析原理二、亲和层析原理 亲和层析是利用亲和层析是利用偶联亲和配基的介质偶联亲和配基的介质为固定相亲和吸附目为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物标产物，使目标产物得到分离纯化的液相得到分离纯化的液相层析法层析法 配基（配基（Ligan

18、d）: 亲和层析中能被某一亲和层析中能被某一生物大分子生物大分子识别和可逆结识别和可逆结合合的生物专一性物质。的生物专一性物质。 基质基质 (Matrix)载体载体: 亲和层析中与配基共亲和层析中与配基共价结合价结合使其固相化使其固相化的物质。的物质。配基配基基质（载体）基质（载体）吸附 (Adsorption) 解吸(Elution )亲和作用中的相互作用力亲和作用中的相互作用力1、静电作用、静电作用2、氢键、氢键3、疏水性相互作用、疏水性相互作用4、配位键、配位键5、弱共价键、弱共价键亲和作用体系亲和作用体系特异性特异性亲和体系亲和体系高特异性高特异性酶酶- -底物、产物、抑制剂底物、产物

19、、抑制剂抗原抗原- -单克隆抗体单克隆抗体荷尔蒙荷尔蒙- -受体蛋白受体蛋白核酸核酸- -互补碱基链段互补碱基链段群特异性群特异性免疫球蛋白免疫球蛋白-A-A蛋白、蛋白、G G蛋白蛋白酶酶- -辅酶辅酶酶、蛋白质酶、蛋白质- -过渡金属离子（过渡金属离子（CuCu2+2+,Zn,Zn2+2+) )凝集素凝集素- -糖、糖蛋白、细胞表面受体糖、糖蛋白、细胞表面受体三、载体的选择三、载体的选择 应具备的特性：应具备的特性： 1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温有丰富的可供活化的化学基团，并在温 和条件下能与配基共价结合。和条件下能与配基共价结合。 2.惰性的，无非专一性吸附或足够小。惰性的，无非

20、专一性吸附或足够小。 3.多孔网状结构。多孔网状结构。 4.良好的机械性能，具有好的液体流动性。良好的机械性能，具有好的液体流动性。 5.有较好的物理和化学稳定性。有较好的物理和化学稳定性。可供选择的载体可供选择的载体 1、琼脂糖、琼脂糖 商品名：商品名：Sepharose 型型 号：号：2B，4B，6B 型号含义：琼脂糖浓度为型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6% 特特 点：点： 亲水性强，理化性质稳定，网孔大，亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附小，只能以湿态保存，经不非专一性吸附小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。起有机溶剂处理。2、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶商品名：商品

21、名：Bio-Gel p型型 号：号：P-100至至-300型号含义：排阻限度，型号含义：排阻限度，X1000相当于允许进相当于允许进入凝胶内部蛋白质的最大分子量入凝胶内部蛋白质的最大分子量 特特 点：干胶，理化性质稳定点：干胶，理化性质稳定,抗微生物侵袭抗微生物侵袭能力较大能力较大,适用于配基和亲和物之间亲和力适用于配基和亲和物之间亲和力比较弱的系统比较弱的系统,应避免在应避免在pH2-11以外的溶液以外的溶液中长期使用中长期使用.3、葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶商品名商品名:Sephadex型型 号号:G-100,150,200型号含义型号含义:每克干凝胶吸水量每克干凝胶吸水量X10特点特点:理化

22、性质稳定理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸耐热耐碱不耐酸,网孔小网孔小 1、小分子物质：辅酶、辅基、小分子物质：辅酶、辅基 2、大分子物质：酶、抗体、大分子物质：酶、抗体 3、纯化酶的配基、纯化酶的配基: 底物、酶活性中心、抑制剂、辅酶等；底物、酶活性中心、抑制剂、辅酶等； 4、纯化抗原抗体的配基：互为配基、纯化抗原抗体的配基：互为配基 5、纯化核酸的配基：、纯化核酸的配基： DNA和和RNA，蛋白质和，蛋白质和mRNA常用的配基：常用的配基：四、配基的选择四、配基的选择 应具备的特性：应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物样品具有专一亲和性对于欲纯化的生物样品具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功

23、能基团必须具备能被修饰的功能基团五、配基的固相化五、配基的固相化 固相化技术：固相化技术： 将配基以共价键连接于不溶于水的将配基以共价键连接于不溶于水的固相基质上制成固相化吸附剂。固相基质上制成固相化吸附剂。 过过 程：活程：活 化化、接接 臂臂 插入剂插入剂或或手臂手臂使小分子配基适使小分子配基适当的离开载体骨架当的离开载体骨架,克服克服载体载体空间位阻空间位阻的的影响影响六、亲和层析六、亲和层析（一）装柱和平衡（一）装柱和平衡（二）上样、亲和吸附（二）上样、亲和吸附 （三）（三）洗脱洗脱 1、非特异性洗脱非特异性洗脱: 改变缓冲液的改变缓冲液的pH、离、离子强度、介电常数子强度、介电常数或

24、温度使或温度使物质构象改变物质构象改变，浓浓缩缩、洗脱洗脱后后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构。速恢复到天然结构。 2、特异性洗脱：利用生物学特异只洗脱特异性洗脱：利用生物学特异只洗脱和配基专一结合的样品，不洗脱由于非专一吸和配基专一结合的样品，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白。附上去的杂蛋白。（四）再生（四）再生 亲和层析柱使用后可用大量洗脱剂连亲和层析柱使用后可用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。理后的层析柱能再次使用。七、亲和层析的应用七、亲和层析的应用 1.抗原和抗体抗

25、原和抗体 2.生物素和亲和素生物素和亲和素 3.维生素、激素维生素、激素 4.激素和受体蛋白激素和受体蛋白 5.凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白 6.辅酶辅酶 7.多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸 8.氨基酸氨基酸 9.染料配体染料配体 10.分离细胞、病毒分离细胞、病毒 11.金属螯合色谱金属螯合色谱 12.共价色谱共价色谱 1、纯化过程简单、迅速。、纯化过程简单、迅速。 2、分离效率高。、分离效率高。 3、实验条件温和。、实验条件温和。 缺点缺点： 1、针对某一分离对象就需要制备、针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件。专一的吸附剂和建立相应的实验条件。 2、配基的选择及其与基

26、质的共价、配基的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤。结合需要烦琐的操作步骤。 优点优点：第四节第四节 高效液相色谱高效液相色谱 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是以液体是以液体为流动相在高压设备作用下高效快为流动相在高压设备作用下高效快速分离样品的色谱技术。速分离样品的色谱技术。 按照固定相不同可分为：按照固定相不同可分为：1、液液分配色谱、液液分配色谱2、吸附色谱、吸附色谱(液固色谱液固色谱)3、离子交换色谱、离子交换色谱4、排阻色谱、排阻色谱(凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱)5、亲和色谱、亲和色谱6、平板色谱、平板色谱(薄层色谱薄层色谱)等等高效液相色谱与经典液相色谱的比较高效液相色谱与经典液相色谱的比较1、高压：高压输液、高压：高压输液 150300Kg/cm22、高速：流速快，、高速：流速快，0.110ml/min,分析速度极快，分析速度极快，只需数分钟完成一次分析，而经典方法完成一次只需数分钟完成一次分析，而经典方法完成一次分析需数小时以上。分析需数小时以上。3、高效、高效、高高分辨：分辨：500塔