LIFECODESHLA-LSA试剂盒说明书详

1、LIFECODES HLA-LSA试剂盒说明书使用目的LuminexHLA I II概要和说明人类白细胞抗原（HLA）是一组免疫系统中通过多态性表现功能性的糖蛋白,在人类免疫系统中起着重要的作用。然而，作为一个高度多态性的系统，HLA分子可以成为在妊娠、输血的血或器官移植后排斥反应的过程中产生的抗体反应的目标。通常，同种异体移植会导致大约33%的个体产生 HLA抗体。这些特异性抗体对移LIFECODES LSATM Class I珠子是设计用来检测Luminex珠子组成，这些珠子耦合了纯化过的重组的LIFECODES LSA TM Class II珠子是设计用来检测Luminex珠子组成，这些

2、珠子耦合了纯化过的重组的植物的存活起着重要的影响。HLA Class I糖蛋白的IgG抗体。LSA Class I是由大量不同的I类HLA糖蛋白。HLA Class I糖蛋白的IgG抗体。LSA Class II是由大量不同的 II类HLA糖蛋白。步骤原理将待测血清与包被了特异T抗原的微珠加入到Millipore微孔板中，经过30min孵育，若血清中存在 HLA抗体则可与微珠上的抗原结合，利用抽真空方法洗涤除去没有结合的抗体或其他杂质，再加入PE标记的二抗染色，孵育后，通过Luminex平台获取特异性结合微珠的荧光信号，再利用软件分析得到特异性抗原类型。步骤原理A确认265100: |LSA1

3、1 LIFECODES LSA TM Class I （24 人份）1. |LSA1B LSA Class I Bead Mix （960 l L）每一个珠子都耦合单一种类的Class I HLA 糖蛋白的混合珠，外加还有4个control微珠。该微珠存储的磷酸盐缓冲液包含有NaCl, Tween-20,叠氮化钠和牛血清。-65C以下避光保存，非避光条件下暴露不得超过三小时。2. LSACJ LSA Conjugate Concentrate （120科L） PE标记的山羊-抗-人IgG 二抗存储的磷酸盐缓冲液包含有 NaCl, Tween-20和叠氮钠。1DIL |使用时用 Wash Buf

4、fer1:10稀释。28c避光保存，不得长时间在非避 光条件下暴露。3. IlSAWB LsAWash Buffer （25 mL）：磷酸盐缓冲液包含 NaCl, Tween-20和叠氮钠。28c保存，在使用 之前平衡到室温（2024 C ）。4. lSAPCI LSA Class I Positive Control Serum （50科L）该血清或者血清混合物是使用HLA 抗原进行同种免疫个体或群体获得，能与大多数LSA Class I微珠反应。血清含 0.1%叠氮钠作为防腐剂，28c保存。5. 1SANC1 LSA Class II Negative Control Serum （50科

5、L）该血清或者血清混合物是从无HLA抗体的同种免疫个体或群体获得，几乎不能与LSA Class I微珠反应。血清含 0.1%叠氮钠作为防腐剂，28c保存。265200: |LSA2 | LIFECODES LSA TM Class II （24 人份）1. LSA2B LSA Class II Bead Mix （960科L）每一个珠子者B耦合单一种类的Class II HLA 糖蛋白的混合珠，外加还有4个control微珠。该微珠存储的磷酸盐缓冲液包含有NaCl, Tween-20,叠氮化钠和牛血清。-65 C以下避光保存，非避光条件下暴露不得超过三小时。2. LSACJ LSA Conju

6、gate Concentrate （120科L） PE标记的山羊-抗-人IgG 二抗存储的磷酸盐缓冲液包含有 NaCl, Tween-20和叠氮钠。D口使用时用 Wash Buffer1:10稀释。28 c避光保存，不得长时间在非避 光条件下暴露。3. |LSAWB |_SA Wash Buffer （25 mL）：磷酸盐缓冲液包含NaCl, Tween-20和叠氮钠。28 c保存，在使用之前平衡到室温（2024c ）。4. LSAPC2 | LSA Class II Positive Control Serum （50科L）该血清或者血清?!合物是使用HLA抗原进行同种免疫个体或群体获得，能

7、与大多数LSA Class II微珠反应。血清含 0.1%叠氮钠作为防腐剂，28c保存。5. SANC2 LSA Class II Negative Control Serum （50科L）该血清或者血清混合物是从无HLA抗体的同种免疫个体或群体获得，几乎不能与LSA Class II微珠反应。血清中0.1%叠氮钠作为防腐剂，28c保存。B警告或注意事项1 .仅用于体外诊断试剂使用。2 .替换提供系统内的其他成分，可能会导致错误的结果。3 .细菌污染的样品或免疫复合物的存在，或其他免疫球蛋白聚集可引起增加的非特异性结合和错误的结果。4 .本产品不能检测IgA和IgM。5 .本产品是根据与 Lu

8、minex配合使用而设计。6 .所有使用完毕的材料要按照要求处理。7 .有关其他信息请参阅材料安全。C储存方法1 .参阅试剂盒组分包装所标记的储存条件。2 .珠子和LMCJS光敏感，避光保存。接触光照不得超过3小时。D使用要求1. 请参阅“标本采集和准备工作。2. LMCJS I Conjugate Concentrate :DIL |使用日用 Wash Buffer1:10 稀释。28c避光保存，不得长时间在 非避光条件下暴露。3. LSAWB LSA Wash Buffer :使用之前平衡到室温（2024 C ）。E不稳定因素1 .不要使用浑浊或者过期的组分和控制试剂。2 .未使用完的稀释

9、过的阴阳性对照和二抗均需扔掉，不能留着下次使用。Luminex仪器和 XY平台。VI样本收集和制备血液在无菌条件下收集,新鲜时进行分离操作,以避免因为不适当的存储条件导致假阳性、假阴性反应或者样本污染。血清在 28c不能超过48小时。如果需要存储超过48小时，则应该在-20C以下温度保存或-80 C存储两年以上。血清应该分离红细胞后进行存储和运输。避免反复冻融。不要使用微生物污染，溶血，脂血，或热灭活血清，因为这些样品可能会产生不一致的相应结果。使用前血清样本用 Vortex充分混合30s,然后800012000转离心45min。试剂说明Negative Control SerumRecord

10、ing SheetPlate Format SheetA试剂盒提供的材料LSA BeadsConjugate ConcentrateWash BufferPositive Control SerumB另行提供的其它材料（试剂盒未提供）Vortex和平板振荡器Millipore过滤板真空泵封板膜Luminex 鞘液Luminex校准珠微型离心机5 mL-50山可调节单道移液器及相应的灭菌Tip头300 mL可调节多道移液器及相应的灭菌Tip头、加样槽1.5-2.0mL离心管试管（为样本或者Control准备）计时器记号笔去离子水使用说明注意：避免 Wash Buffer和Conjugate Co

11、ncentrate试剂被污染。如果这些试剂被人血清污染，则其会与 anti-Human IgG反应造成结果失败。控制真空压力，压力过强会使珠子与膜粘连无法悬浮，从而导致Luminex读珠子数失败。向过滤板加液时注意不要用枪头碰触过滤膜，避免过滤膜被捅破。孵育的时候要保证珠子不要被甩到溅出或者黏在两侧孔壁上。如果第一次实验，不确定震荡效果，可以加入几个阳性或阴性对照，确保摸索到最佳的振荡或旋转速度。无论是过量的血清还是洗涤不彻底，都可能降低对检测结合到珠子上IgG的分析能力，导致错误结果。建议每次实验需要加入阳性或者阴性血清，以帮助确定是否是技术错误还是试剂变质导致错误结果。1 .从冰箱里拿出

12、LSA微珠混合物并将其置于室温条件下避光处解冻，然后将放在冰上避光。注意：微珠可以反复冻融冻结和解冻至少6次，而不会影响其性能。2 .其他试剂于28c避光放置，将Wash Buffer置于室温平衡。将待测血清和阴阳性指控血清编号排列，按照millipore反应孔相对应的位置填写Plate Format Sheet,使加样的顺序与 Plate Format Sheet格局相一致。3 .用封板膜贴住未使用的Millipore反应孔，在反应孔中加入100心300 L ddH2O润湿滤膜，2-5min后用真空泵抽掉ddH2O。4 .将LSA beads低速离心数秒，收集管冒和管壁上的混合液，vorte

13、x 1 min使微珠充分混匀。5 .每个反应孔加入 40山LSA Beads ,当转移珠子时，每两分钟震荡一次珠子，保证珠子悬浮。 注意：务必充分混匀微珠，以保证每个反应孔都加入足够的微珠，否则会影响上机读板的时间以及结果 的判读。6 .盖上封板膜，用锡纸包严反应板，使用平板震荡器室温孵育30min。将未使用的对照血清放回至2C 8c避光储存，LSA Beads放回至-65 C以下避光储存。7 .用Wash Buffer 1:9稀释二抗（5比二抗加45山Wash Buffer）,为了弥补加样误差， 每次多配制一个反应。二抗稀释好后，避光放置，并将未使用的二抗溶液放回至2C8c避光存储。8 .步

14、骤6结束后，揭开封板膜，每反应孔加入100山Wash Buffer, vortex小心混匀后用真空泵抽掉液体。注意：真空泵的压力不要太大，否则会导致珠子吸附至膜上无法悬浮导致微珠读数失败。抽真空时，使 用的压力大小以能够使孔内液体下降较缓慢为宜。9 .250 L Wash Buffer, vortex注意：洗涤不充分，会降低二抗与微珠上结合的IgG的结合能力，导致假阴性结果。10 .每孔加50 ML稀释的二抗，盖上封板膜，用锡纸包严反应板，使用平板震荡器室温孵育30min。11 .每孔加130150山Wash Buffer ,小心vortex重悬微珠。使用完毕后，可将剩余未使用的Wash Bu

15、ffer放入2C8c保存。12 .上机读板。注意：建议在3h之内进行上机操作，否则会增加假阳性和假阴性的可能。Class I & Class II :每个珠子原始的MFI值均写入工作表( Worksheet )确定是否一个珠子为阳性，首先用这个珠子的RAW MFI减去这个珠子的 Background MFI ,生成“矫正值1(Adjust Value 1) "。Background MFI是由珠子变化造成的背景干扰，其值可以在 Recording Sheet内查到。“矫正值 1”除以具有各自基因座位的CalcCON(Calculated Control)的MFI生成“矫正值

16、2 (Adjust Value 2)每一个基因座位的CalcCON是相应基因座位排列最低的抗原珠子的原始MFI值。(Individual Bead MFI - Background MFI)CalcCONFMFIfor locus1=Adjust Value 2for antigen' x'fromlocus 1(Individual Bead MFI - Background MFI)CalcCONFMFIfor locus2=Adjust Value 2for antigeny'fromlocu2(Individual Bead MFI - Background M

17、FI)CalcCONHMFIfor locus3=Adjust Value 2for antigenz'fromlocu3生成Adjust Value 3 ,用Adjust Value 2除以的每个珠子上相应的抗原量来。质量控制产品包含一个阳性对照一个阴性对照,对照血清应该在每一次实验都设立,用以帮助确定是技术错误还是试剂失效导致检测结果出错。阳性对照血清可以与大量的 LSA珠子反应。阴性对照血清可以与极少量的LSA微弱反应产生低于2000 MFI的原始MFI值。珠子包含4个控制珠子来监控每一个样本的表现。阳性对照珠子表面耦合人IgG并于阳性对照血清结合产生大于2000的MFI值。如果

18、对照血清卞测值低于2000 MFI ,则可能是由于洗涤不充分或者耦合不完全造成的影响。同样，阴性对照珠(CON1, CON2, CON3)通常会与阳性对照血清显示低的MFI值。故障排除问题可能的原因解决方法微珠数量不够Probe mix未能充分悬浮预热，超声(有条件用户)，vortex 混匀probe mix ,重复进行实验Luminex仪命未正常工作未进行校准见Luminex用户指南样本流路阻塞见Luminex用户指南珠子被光漂白使用新批号真空压力太大，珠子吸附再摸上减小真空压力控制值超过阈值清洗不彻底重新并控制清洗样本质量低重新提取光漂白LMCSJ使用新批号阳性对照阈值失败洗板不彻底重新并控制清洗阳性对照血清峰形 异常添加样品出错重新并使用正确对照控制样本清洗不彻底重新并控制清洗阴性对照血清MFI值高(adj. val.1>300 MFI)清洗不彻底重新并控制清洗，确保洗涤过程 中珠子悬浮。减少真空压力实验步骤局限性错误的结