RNA提取的原理与方法

1、RNA 提取的原理与方法RNA 提取的原理与方法细胞中的RNA可以分为信使 RNA、转运RNA和核糖体 RNA三大类，不同 组 织总RNA 提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白，DN A等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。RNA提取流程L样品处理从各种不同来源样品（如 细菌、醉母、血液 、动物组织、植物组织和培养 细胞），或同一 来 源样品的不同组织 （如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等）中提取高质址的RNA,因细胞结构 及所含的成分不同，样品预处理的方式也各有差异。样品肋要戎最好使用新鲜的样品或取样后立即在低温 <-2o c或-1o c）冷冻保存的样品，避免 反

2、复冻融，因 为这会导致提取的RNA降解和提取址下降。样品预姓型方式植物材料-液氮研磨动物材料-匀浆、液氮研磨细菌-溶菌幅破壁醉母-液氮研磨、玻璃珠处理、混合幅破壁2 .细胞裂解异磅笳酸腑苯酚法（TRIZOL ）这是一种传统的 RNA提取方法， 适用于大部分动植物 材料，但对 于次生代谢 产物较多的植 物 材料提取 RNA效果较差。异硫氤酸肌能使核蛋白复合体解离 ，并将 RNA释放到溶液中， 采 用酸性酚 氯仿混合液抽提，低PH值的 酚将使RNA进入水相，而蛋 白质 和DNA仍留在有机 相，从而可以完成RN A的提取工作。该法应用非常广泛，适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材

3、料，同 时还适用于次生代谢物较少的植物性材料，如幼苗、幼叶等。该法主要应用在动物组织和培 养细胞的RNA提取中。l川纣/3-资基乙醇法适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。在这种方法中，抓 盐使细胞充分裂解，13 -硫基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制RNaseA的活性，保护 RNA不被降 解。我公司的"GREEN "系列总RNA提取试剂盒是基于这种方法开发的产品，分别适用 于各 类不同的材料。此系列产品的具体实验步骤和适用范围在实验技术手册中有详细介绍，实 验 者可根据自己的需要进行选择。其它方法有些植物材料多糖多酚含垃较高，如植物果实，番茄的叶子等，有

4、些植物木质化程度较高，如根茎等组织。针对这类材料本公司推出了一种全新的植物总RNA提取试剂，该试剂特 别适合于从富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取纯度高、完整性好的总RNA,有关的具体步骤将 在分论中详细介绍，实验 者可根据自己的需要进行选择。3 . RNA纯化及获得纯化要求RNA样品中不应存在对幅（如逆转录幅）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避 免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除 DNA分子的污染。 纯化方法及沉淀 方法一：有机溶剂抽提法 氯仿抽提 在使用RNA提取试剂进行 RNA提取时，常使用氯仿进行抽提，以去除 庶糖、蛋 白等杂质， 并促进水相与有机 相的 分离

5、，从 而达 到纯 化RNA的方法。在本公司的提取 RNA的产品中， 与TRiz ol同型试剂法及其衍生试剂盒。 沉淀氯仿抽提RNA后，一般采 用了异 丙 醇或 乙醇来 沉淀水相 RNAo加入0.6倍水相体积的异丙 醇或与水相等体 积的异丙醇，室温 沉淀20-30分钟，高速 离心，可获得 RNA沉淀。 洗涤沉淀加入无 RNase的75%乙醇，将RNA沉淀振荡悬浮，使 RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。然后再离心 10-30分钟。再次沉淀 RNAo离心后，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），随后快速离心1-2秒，将残留在管壁上的乙醇手机到管底后，用小枪头吸净，超静台中风干 1-2分钟（注意 不要

6、皖得太干， 否则RNA沉淀不易溶解）。溶解沉淀加入适垃 RNase-freeddH20溶解RNA沉淀。方法二：硅基质吸附法随着实验方法的改进，现已发展出一种 采用吸附材料纯化核酸的方法。目前较常见的有：硅 基质吸附材 料、阴离子交 换树脂和磁珠等。硅基质吸附材 料因其具有 可特异吸附核酸，使用 方便、快捷、不使用有毒溶剂如苯酚、氯仿等优点，成为核酸纯化的首选。本公司生产的总 RNA 提取试剂盒 （ZP403-ZP407）和GREEN spin系列总RNA提取试剂盒 即采用硅基质吸附达到 RNA分离纯化目的，通 过专一 结合RNA的离心吸附柱和独特的缓 冲液系统 使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结

7、合，而蛋白、有 机溶 剂等 杂质不 能结合到膜上而被洗脱，盐类 则被 含有乙 醇的漂 洗 液洗 涤，最后用RNase-free ddH20将RNA从硅胶膜 上 洗脱下来。一些特殊组织的RNA提取纤维组织心脏/骨骼肌等纤维组织提取 RNA的关键在千彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，单位 重址 的 组织中RNA含址较低， 建议增加起始址。止匕外，一定要在 液氮 中 将组织彻底磨碎。蛋白/脂肪含品较高的组织脑或植物脂 肪含址高，酚/氯仿抽提后，上清含白色絮状物。必须用氯仿再次对上清进行抽 提。核酸戊N as e含址高的组织脾、胸腺等组织的核酸和 RN ase含垃很高，在液氮 中研磨，再快速 匀浆，能

8、有效灭活RNase。如加入裂解液后变得粘稠，酚I氯仿 抽提 不能有效分层，则加入更多裂解液可以解决此问题。多次酚/氯仿抽提可以去除更多残留 的 DNA。如果加入乙醇后马上有白 色沉淀形成，表明可能 有DNA污染，可以在 核酸溶解后用酸 性酚I氯仿 再次抽提 或者用Dna sel消化，去除D NA污 染。植物组织和真菌组织植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂，一般选择在液氮条件下对样品进行研磨，以避免 内源RNase降解RNA。如果RNA降解问题不能解决， 大多 数情 况下 是样 品中含有的杂 质 所致。许多植物和真菌中的内含杂质和多糖、多酚等都会残留，因 为这些杂质 分子与 RNA 有一些相似

9、性，可 与RNA同时沉淀或者吸附，因 此在 植物和 真菌 组织的提取中，需 要用一些 特 别的步骤或者特 别的 试剂来去除多糖多酚等杂质 的 干扰和污染。RNA评价与鉴定提取得到 RNA溶液后，我们需要对 RNA进行相关的质 垃检测，以确 定它是否符合后续实 验的要求。RNA用于不同的后续实验，对 其质泣要求不尽相同。cDN A文库构建要求 RNA完整且无幅等抑制物残留 ；Northern blot实验对RNA完整性要求较高，对幅反应抑制物残 留 要求较低；RT - P C R实验对RNA完整性要求不太 高，但对幅反应抑制物残留要求严格 。因此 在进行不同的实验时应选择不同的方法纯化RNA,以

10、达到最佳的实验效果。RNA得率检测一分光光度计法RNA得率有很强的组织特异性，不 同组织 RNA的度和 RNA提取的易难程度共同决定了该 种组织的RNA得率。一般来说，可通 过分 光光度 计测 定RNA溶液在260nm处的吸光 值来 计算 RNA的含址。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm处，l ug/ mlRNA钠吸光 度0.025 （光程为1cm）,即0 D260=1时，样品中RNA 浓度为40ug/ml。通常分光光度计0 D260的读数要介于0.15 -1.0之间才是可靠的。因此RNA提取结束后，要根据大概产 谥稀释 到适当浓度范围，再用分 光光度计检 测。按下 面的共识 计算总RNA浓度：总RNA 浓度（ug/ml） =0D260X稀释倍数 X4 0ug/mlRNA纯度检测.分光光度计法通过0 D2612&0来检测RNA纯度，0D260120